组织切片免疫组化_张

组织切片免疫组化雄鼠肾囊膜移植ES cell 4-6周处死小鼠,1多聚甲醛固定4保存无限时, 1. 脱水50乙醇30min60乙醇30min70乙醇 过夜80乙醇 60min90乙醇 60min95乙醇 20min95乙醇 25min100乙醇 20min100乙醇 25min透明 以上每次移前快速用滤纸吸,但不能干,组织块轻夹,避免损伤,或者将组织快放在离心管中,依次加入不同浓度的乙醇,每次更换时,吸出大部分的乙醇,将剩余的连组织块倒在滤纸上,再立即反过来将组织块导入离心管,再加下一个浓度的乙醇 液液之间误差约为1min,进入后摇晃2. 透明 100乙醇苯1：110min 苯 过午苯 10min浸蜡3. 浸蜡62 恒温箱,将组织块放在铁网中,挨个转移 蜡10min蜡20min蜡 20min 4. 包埋：石蜡盒底部事先用手指涂点甘油,石蜡未凝固时将组织块拟切面朝下中间放置,盖上镂空塑料托,石蜡凝固后,自来水,完全冷却后,将包埋盒与塑料托分离,组织块应该留在托一边,收藏好等待切片避尘蜡若凝固于组织块外围,将器皿搁酒精灯上烤烤,化后移入温箱组织块由苯移入蜡时,瓶边靠上即可,不用滤纸,在蜡之间移动组织块要快,尽量避免凝固用苯替代二甲苯透明可放置较长时间,组织块不易脆5. 切片6. 展片,贴片卧式染缸2/3蒸馏水+10滴蛋清甘油, 混匀；将蛋清甘油水溶液摸匀载玻片上,磨砂面朝上；将玻片在酒精灯火焰上晃3-5下夏天或6-8下冬天用手术刀取一段适宜长度的切片,移到载玻片液滴上,光面朝下；用展片针将皱的组织展开用手术刀分开组织片段,移于另一载玻片事先蛋清甘油水溶液滋润中间；组织方向尽量保持一致根据形状,或有绒毛的朝上置于片盘上,做好标记；移入恒温箱前,不能让切片干掉,要保持适度湿润否则切片烤后不牢,但切片周围尽量不要留有蛋清甘油,以免染色后影响片子美观；移入48恒温箱,烤片,过夜,2天都行。7. 染色,封片1.脱蜡 二甲苯 3min 二甲苯 3min100乙醇 5min100乙醇 5min95乙醇 5min95乙醇 5min90乙醇 5min80乙醇 5min70乙醇5min自来水 3min蒸馏水 3min染色或修复,抗体,显色,如果作免疫组化不能用脱过伊红的酒精去脱水木精 7min染色前将漂浮的氧化物用滤纸捞起,要慢放慢提,避免将沉淀悬浮起自来水漂洗5min置盆中流水冲洗,水不能直接冲在玻片上酸酒精 浸提N次4次根据分况定自来水漂洗5min回色 漂洗前先用自来水洗一遍漂洗后观察分况蒸馏水 3min 伊红 5min 若置于90酒精中褪色很快,往伊红中加200ml冰醋酸,搅匀,重复染色至深桃红染色稳定后一般不再加冰醋酸70乙醇 浸提80乙醇 浸提90乙醇 3min95乙醇 5min95乙醇 5min100乙醇 5min100乙醇 5min二甲苯100乙醇1：1 3min二甲苯3min二甲苯3min 浸在二甲苯中,一片封完取另一片封片封片擦干二甲苯中性树胶滴于组织边盖玻片朝上一面酒精灯上晃一下去水分盖玻片一边小心置于树胶液滴外沿轻轻盖上组织应在中间置片盘晾干片盘晾干从脱蜡起直至封片,注意组织片均不能干看片时,若是木精颜色有点发黑,说明透明时组织干了看片时,若发现杂质,一要注意木精染色时要去氧化物,染色时要轻放轻取,二要在自来水漂洗前将水龙头包上棉花,纱布过滤免疫组化：修复柠檬酸缓冲液放在烧杯中,置于水浴中,当柠檬酸缓冲液温度达到95度时,将玻片放入柠檬酸缓冲液中,当温度达到92度开始计时92-98度30min,取出凉到室温,再将玻片取出,柠檬酸缓冲液只能使用一次,我放置了2.5hr才取出。然后蒸馏水洗,PBS洗5min,3次,最后一次时间可长,1擦去玻片周围的水,放置在湿盒中,加B液,盖上湿盒；2再取另一片重复上一步,大约9片后计时15min；然后全部结束；3.时间到后,从第一片开始取出玻片用蒸馏水冲洗2-3次,放入浸在PBS的架子上,继续另一片；4全部结束后计时5min,3次,期间提起架子混匀液体;5.最后一次洗涤时间到后,取出按照1和2的步骤加一抗,和空缺一抗对照；注意放置一抗过夜时一定要放平湿盒,保证液滴不流,否则标本会干6重复3和4步7 重复5加A液8重复69重复5加DAB显色液6min10蒸馏水冲洗,终止显色,浸入蒸馏水中的架子上；木精复染同前木精染色。直至封片。试剂的配制：1. 各级浓度酒精2. 1伊红：1g曙红Y溶于100ml 70乙醇中3. Harris 木精1g10ml 无水乙醇充分溶解钾矾20g200ml 蒸馏水搅拌煮沸 木色精,润捷化学试剂,进口分装；生化试剂。十二水合硫酸铝钾,西陇化工厂4. 木精酒精液搅拌缓慢矾液微沸即加氧化汞0.5g逐渐少量加入,边加入边搅拌,防止染液溅出冷水浴过滤准备实验时配制,若染不上再配红色氧化汞西陇化工厂5. 苦味酸饱和水溶液 苦味酸2.4.6三硝基酚picric acid6. 酸酒精1%盐酸1ml盐酸 100ml 70酒精 盐酸：市西陇化工厂7. 石蜡： 蜂蜡：石蜡=1:9融化过滤备用蜂蜡熔点62-67；华永石蜡,华申牌,高效切片石蜡high effect paraffin ceresin：熔点56-58,专供人体、动植物组织切片使用,华灵康复器械厂出品,复旦大学医学院病理教研室监制,华灵牌8. 蛋清甘油：蛋清打成水样,去泡沫4-5层纱布过滤蛋清：甘油1：11麝香草酚加到有味即可 甘油：光华化学.组织切片1. 将蜡块用保安刀切成略梯形,组织上下留有空蜡约4mm,左右留有约3mm；2. 将贴有蜡块的塑料托,装上切片机,再装切片刀,3. 粗调刀架与组织块平面距离及清除角将刀刃与组织平面之间留一很小的角度间隙,约3-8度,以免切片时刀刃面或其下缘将组织刮坏4. 细调距离：左右手配合,组织块转到上方时,左手旋转调整距离,反复到有完整组织切片出现。切过程再对清除角进行修正；5. 若切片不挺,可用冰块冰镇1min左右,组织块上的水份用毛巾轻吸,冰镇前记住锁定手轮,推上护刀架；6. 若切片卷曲,表明刀口不利,换个位置再切移动刀架的锁钮要轻拉,轻扣换位前记住锁定手轮,推上护刀架7. 切片时要匀速。切片用松散的羊毫毛笔松卷从蜡片带背面托起,防止粘连；8. 将蜡片背面光面平铺于片盘上,并加盖,盖子采用推拉,不能用掀,否则切片会飘起,记住编号；9. 清扫刀架上的蜡片时,用毛笔往刀口方向扫,以防切割；10. 切好后片盘托起搁4,并注明：品名,制作人,时间；11. 锁定手轮,推上护刀架。组织脱水浸蜡过程详解 .microimage.-组织经过透明剂的完全透明后,被移放于65左右熔化的石蜡中,于65的电热恒温箱中浸渍的过程称为浸蜡。组织在脱水时,组织中的脂类和类脂等物质在脱水剂的作用下被溶解掉,留下了许多腔隙,许多管腔组织和血管,也有许多腔隙,这些都严重地影响了切片。组织浸蜡时,由于诱导剂二甲苯的作用,石蜡进入到组织的各个角落,并在各个角落中保存下来。当石蜡包埋后冷却时,这浸入到里面的石蜡便可起到支撑的作用,而且使组织不致于变形,塌陷等现象,使切片能完整的切出,便于镜下观察。组织浸蜡据多次文献报到必须换几次不同熔点的石蜡。石蜡有软蜡和硬蜡之分,软蜡的熔点有45、5254。硬蜡的熔有5658,5860、6062。浸蜡的顺序 是先软蜡,后硬蜡,浸蜡的时间根据组织不同而确定不同的时间。有的人指出组织浸蜡先放入二甲苯与石蜡等份混合的液体中浸渍然后再放入软蜡、硬蜡。根据使用经验我认为不必要这样做。因为组织经二甲苯或其它透明剂透明后,在组织进入石蜡时,自己还带着残存的透明液,如为手工操作,可将组织块控干,尽量减少残存液的存在,而自动脱水机则不然,组织可存留一定量的透明剂,经使用次数多次后,残存的透明剂可把石蜡稀释。因此机器程序处理的次数较多时,应注意换石蜡,以防组织浸蜡效果不好。一、石蜡的性质 石蜡是一种碳氢化合物,由矿物油的分裂产生,它的性质是相当的不同,其熔点在4562之间。熔点高的为硬蜡,硬度较高,适合于夏天切片的用蜡,熔点低的为软蜡,54以下的称为软蜡,这种适合于组织化学的切片用蜡。根据石蜡的特点,根据季节的不同,合理地使用不同熔点的石蜡,这是能否切好片,使切片产生带状的关键。二、石蜡性质的改善为了获得较好的连续切片,人们想出了许多种方法,对石蜡进行改造,使石蜡的硬度和柔软性更适合于佳片的切出,提出了许多种方法：石蜡加热冷却法 刚购入的石蜡,不管是动植物切片石蜡也好,还是工业用蜡也好,都必须进行处理,方法是:将石蜡放于容器里,于电炉上加热,此时石蜡遇热熔解并发出哔哔吧吧的声音,这是石蜡中含有的杂质,遇热后分解所发出的声音,随着时间的延长,温度的升高,这种声音将逐渐减少,直至消失。此时可将盛装石蜡的容器浸入冷水中,石蜡凝结后,再继续加热,如此反复几次即熔化冷却熔化冷却。这种处理方法,可增加石蜡的密度和可塑性,除去杂质。为达高质量的切片,这是必经之法。增加和改善石蜡的韧性和粘度 这种方法则需要加入一些东西才能获得,如蜂蜡和硬脂肪,蜂蜡最高熔点可达70余度,增加它可增加石蜡的硬度。石蜡切片切45um,60左右的石蜡可支撑得起,如要切13um,其硬度则不够,因此,要制出较薄的切片,石蜡硬度一定要过关。另外,增加石蜡的硬度还可以加入脂蜡酸、柏油、梅蜡等,虽然如此,石蜡经处理后,用时的颜色如肥皂一样为最好。在了解了石蜡的性质及如何改造它后,下面再了解组织浸蜡。三、传统浸蜡法这是手工操作和不带真空负压的浸蜡方法。根据石蜡的熔点,确定浸蜡箱的温度。如硬蜡的熔点为62,浸蜡箱的温度应比石蜡熔点高出23,即浸蜡箱调在65,当确定好后,将组织放入软蜡,后转入硬蜡,根据不同的组织,组织的大小来确定浸蜡时间,小组织2030分钟,大组织几个小时不等。四、真空负压浸蜡法真空负压浸蜡法应用一真空泵,将箱的空气抽出来,形成真空负压,在这种条件下,由于失重,各种分子活动加快,促使浸蜡过程迅速完成。为了浸蜡完全彻底,全密闭自动脱水机配有这一功能。 浸蜡方法鼻咽部、宫膜穿剌物、排出物甲状腺、肝、脾肾、淋巴结子宫肌、平滑肌胃、肠、横纹肌等所需温度传统浸蜡法4090 min90150 min180 min以上65度真空负压浸蜡法15 min2530 min60120min70度 真空负压所需压力表40KP4053KP66.7KP真空负压浸蜡法使用时的注意事项：真空恒温干燥箱的温度应略高于传统浸蜡法,因为在抽气形成真空时,箱中的热气会被抽出,致使箱中温度下降,使熔化的石蜡凝结成块,所以温度调至70度左右为宜。 计时应从浸蜡完全熔化时计起。抽气时,箱中的温度下降,此时浸组织块的蜡如果处于凝固时,应待其熔化后,方可计时。 附：几种组织处理程序。 、常规组织处理程序1、组织块冲水24小时。2、70%酒精24小时。3、 80%酒精12小时。4、 90%酒精12小时。5、 95%酒精12小时。6、 95%酒精22小时。7、 100%酒精11小时。8、 100%酒精21小时。9、 二甲苯13060分钟。10、二甲苯23060分钟。11、 软蜡1小时。12、 硬蜡23小时。胃肠粘膜处理程序1、70%酒精10min。2、 80%酒精10min。3、 90%酒精10 min。4、 95%酒精10min。5、 100 %酒精10min。6、 二甲苯510 min。7、 浸蜡15 min。 临床手工脱水法。1、80%酒精过度。2、 95%酒精过夜。3、 100%酒精11小时。4、 100%酒精21小时。5、 二甲苯13060 min。6、二甲23060 min。7、 浸蜡真空负压90120 min。 全密闭柜式自动脱水机脱水法室温。1、10%缓冲福尔马林2小时。2、90%酒精2小时。3、95%酒精2小时。4、 95%酒精1.5小时。5、 95%酒精1小时。6、 100%1酒精1小时。7、 100%2酒精1小时。8、 100%3酒精1小时。9、 二甲苯40 min。10、 二甲苯40 min。11、 石蜡11小时。12、 石蜡21小时。共14小时50 min。全密闭柜式自动脱水机脱水法加温至40度。全密闭柜式自动脱水机脱水法真空负压。注：5、6法详细步骤同4法。全密闭柜式自动脱水机周末脱水法。1、10%缓冲福尔马林20小时2、 90%酒精20小时。3、 95%酒精5小时。4、 95%酒精5小时。5、 95%酒精3小时。6、 100%酒精3小时。7、 100%酒精1小时。8、 100%酒精1小时。9、 二甲苯40min。10、二甲苯40 min。11、石蜡11小时。12、石蜡21小时。共61小时20分钟6 / 6