实验报告材料9

word 微生物的生理生化反响某某：X弛 学号：201100140157 班级：生院2011级生物基地生北周一第六组 同组者：关事成、钱丹丹、喻心仪、X婷婷、钟天白一、 实验目的1、 证明不同微生物对各种有机大分子物质的水解能力不同，从而说明不同微生 物有着不通过的酶系统。2、 掌握进展微生物大分子物质水解试验的原理和方法。 3、 了解糖发酵的原理，掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。4、 了解吲哚和甲基红试验的原理以与其在肠道细菌鉴定中的意义和方法。二、 实验原理 微生物的生理生化反响原理：在所有生活细胞中存在的全部生物化学反响称之为代谢。代谢过程主要是酶促反响过程。许多细菌产生胞外酶，这些酶从细胞中释放出来，以催化细胞外的化学反响。各种细菌由于具有不同的酶系统，致使它们能利用不同的底物，或虽然可以利用一样的底物，却产生不同的代谢产物，因此可以利用各种生理生化反响来鉴别细菌。 大分子水解：微生物对大分子的淀粉、油脂不能直接利用，必须靠产生的胞外酶将大分子物质分解后才能被微生物吸收利用。微生物的胞外酶如淀粉酶、脂肪酶等主要为水解酶，将大分子物质分解的过程可以通过观察细菌菌落周围的物质变化来证实。淀粉遇碘液会产生蓝色，但细菌水解淀粉的区域，用碘测定不再产生蓝色，明确细菌产生淀粉酶。脂肪水解后产生脂肪酸可改变培养基的PH，使PH降低，参加培养基的中性红指示剂会使培养基从淡红色转变为深红色，说明细胞外存在脂肪酶。 糖发酵试验：是常用的鉴别微生物的生化反响。某些细菌能利用糖类作为碳源和能源，使糖类分解为产酸产气或产酸不产气。不同种的细菌对于各种糖类利用能力不同，分解产物也不同。大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气；普通变形杆菌只能分解葡萄糖产酸产气，不能分解乳糖。发酵培养基含有蛋白胨、指示剂溴甲酚紫、倒置的德汉氏小管和不同的糖类。当发酵产酸时，溴甲酚紫指示剂可由紫色PH6.8转变为黄色PH5.2。气体的产生可由倒置的德汉氏小管中有无气泡来证明。吲哚实验：用来检测吲哚的产生，有些细菌产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸，产生吲哚和丙酮酸。吲哚与对二甲基氨基甲醛结合，形成红色的玫瑰吲哚。但并非所有的微生物都具有分解色氨酸产生吲哚的能力，因此吲哚试验可以作为一个生物化学检测的指标。甲基红实验：用来检测由葡萄糖产生的有机酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。当细菌代谢糖产生酸时，培养基就会变酸，使参加培养基中的甲基红指示剂由橙黄色PH6.3转变为红色PH4.2，即甲基红反响。大肠杆菌和产气肠杆菌在培养的早期均产生有机酸，但大肠杆菌在培养的后期仍能维持酸性PH4，而产气肠杆菌如此转化有机酸为非酸性末端产物，如乙醇、丙酮酸等，使PH升至大约6。因此，大肠杆菌为阳性，产气肠杆菌为阴性。三、 实验器材1、 菌种：枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌大分子水解试验 大肠杆菌、普通变形杆菌糖发酵试验 大肠杆菌、产气肠杆菌吲哚试验 大肠杆菌、产气肠杆菌甲基红试验2、 培养基：1固体淀粉培养基，固体油脂培养基大分子水解试验2葡萄糖发酵培养基、乳糖发酵培养基试管各3支内装有倒置的德汉氏小管糖发酵试验3蛋白胨水培养基吲哚试验4葡萄糖蛋白胨水培养基3、 溶液和试剂：卢戈氏碘液，乙醚，吲哚试剂，甲基红试剂，蒸馏水，中性红 试剂等 4、 仪器或其他用具：培养皿，试管，酒精灯，烧杯，德汉氏小管，接种环等 四、实验步骤A大分子水解试验1粉水解试验 1配制固体淀粉培养基，灭菌，待培养基冷却至50左右，无菌操作制成平板。2用记号笔在平板底部划成四局部3将枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、和铜绿假单胞菌分别在不同的局部点种，在平板的反面对应局部分别写上菌名4将平板倒置，在37温箱中培养24小时5观察各种细菌的生长情况，打开平板盖子，滴入少量卢戈氏碘液于平板中，轻轻旋转平板，使碘液均匀铺满整个平板如菌苔周围出现无色透明圈，说明淀粉已被水解，为阳性。透明圈的大小可初步判断该菌水解淀粉能力的强弱，即产生胞外淀粉酶活力的上下。 2. 油脂水解实验1配制固体油脂培养基，灭菌，待培养基冷却至50左右，无菌操作制成平板。2用记号笔在在平板底部划成四局部，分别在四局部表上菌名3用无菌操作将枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌和产气肠杆菌分别划十字线接种于平板相对应局部的中心4将平板倒置，在37温箱中培养24小时 5取出平板，观察菌苔颜色如果出现红斑点，说明脂肪水解，为阳性反响B糖发酵实验1用记号笔在各试管外壁上分别标明发酵培养基的名称和所接种的细菌菌名2取葡萄糖发酵培养基试管3支，分别接入大肠杆菌、普通变形杆菌，第三支不接种，作为对照。另取乳糖发酵培养基3支，同样分别接入大肠杆菌、普通变形杆菌，第三支不接种，作为对照。3将接过种和作为对照的6支试管均置37中培养2448小时4观察各试管颜色变化与德汉氏小管中有无气泡C吲哚实验（1） 将大肠杆菌、产气肠杆菌分别接入3支蛋白胨水培养基，置37培养48h（2） 在培养48h后的蛋白胨水培养基内参加34滴乙醚，摇动数次，静置1min，待乙醚上升后，沿试管避徐徐参加2滴吲哚试剂。在乙醚和培养物之间产生红色环状物为阳性反响。D甲基红试验1将大肠杆菌、产气肠杆菌分别接入3支葡萄糖蛋白胨水培养基，置37培养48h2培养48h后，将1支葡萄糖蛋白胨水培养基培养物内参加甲基红试剂2滴，培养基变为红色者为阳性，变为黄色者为阴性。五、实验结果结果记录表1“+表示阳性，“-表示阴性菌名淀粉水解实验油脂水解实验枯草芽孢杆菌+大肠杆菌铜绿假单胞菌+结果记录表2“+表示产酸或产气，“-表示不产酸或不产气糖类发酵大肠杆菌普通变形杆菌对照葡萄糖发酵+乳糖发酵+结果记录表2“+表示产酸或产气，“-表示不产酸或不产气菌名实验名称吲哚实验甲基红实验大肠杆菌-+产气肠杆菌-六、 须知事项1、 淀粉水解试验中，观察各种细菌生长情况时，滴入少量卢戈氏碘液于平板中，应轻轻旋转平板，使碘液均匀铺满整个平板。2、 油脂水解试验中，制备固体油脂培养基时，应充分摇荡，使油脂均匀分布。3、 接种前要用记号笔做好标记，接种时要对号接种。4、 糖发酵试验中，接种后要轻缓摇动试管，使其均匀，防止倒置的小管进入气泡。否如此会造成假象，得出错误的结果。5、 吲哚试验中，注意参加34滴乙醚，摇动数次，静置1min，待乙醚上升后，再沿试管壁徐徐参加2滴吲哚试剂。否如此就会观察不到在乙醚和培养物之间产生的红色环状物。6、 甲基红试验中，应该注意甲基红试剂不要加得太多，以免出现假阳性。七、 思考题1 你如何解释淀粉酶是胞外酶而非胞内酶？答：1淀粉是大分子物质，进入细胞十分困难，甚至需要触与高耗能的胞吞作用。因而通过胞外酶的作用，将淀粉水解为葡萄糖后运入细胞，较方便高效。（2） 试验中出现透明圈，说明培养基内淀粉被水解，可推测是细菌产生的胞外的淀粉酶起的作用。2 不利用碘液，你能否证明淀粉水解的存在? 答：由于淀粉水解生成葡萄糖，即多羟基醛，因此可利用醛的性质进展检验，如银镜试验，费林试验等。 3 假设某些微生物可以有氧代谢葡萄糖，发酵试验应该出现什么结果？答：微生物有氧代谢葡萄糖产气不产酸，因此发酵结果是小管中生气泡但是溶液不变黄4 解释在细菌培养中吲哚检测的化学原理，为什么在这个试验中用吲哚的存在作为色氨酸酶活性的指示剂，而不用丙酮酸？答：化学原理：有些细菌产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸，产生吲哚和丙酮酸。吲哚与对二甲基氨基甲醛结合，形成红色的玫瑰吲哚。但并非所有的微生物都具有分解色氨酸产生吲哚的能力，因此吲哚试验可以作为一个生物化学检测的指标。 因为丙酮酸是生物体呼吸作用的产物，无论是有氧还是无氧，都会产生丙酮酸，因而无法作为色氨酸酶活性的指示剂进展区分。 同时吲哚能通过有明显颜色变化的化学反响观测到，而丙酮酸不能，所以试验中用吲哚的存在作为色氨酸酶活性的指示剂，而不用丙酮酸5 为什么大肠杆菌是甲基红反响阳性，而产气杆菌为阴性？答：当细菌代谢糖产生酸时，培养基就会变酸，使参加培养基中的甲基红指示剂由橙黄色PH6.3转变为红色PH4.2，即甲基红反响。而大肠杆菌和产气肠杆菌在培养的早期均产生有机酸，但大肠杆菌在培养的后期仍能维持酸性PH4，而产气肠杆菌如此转化有机酸为非酸性末端产物，如乙醇、丙酮酸等，使PH升至大约6。因此，大肠杆菌为阳性，产气肠杆菌为阴性附表：试验中所需培养基配方5 / 5