肠道微生物作为环境因素调节脂肪储存

精选优质文档-倾情为你奉上肠道微生物作为环境因素调节脂肪储存和能量摄取、吸收或储存有关的非认知性的减少的药物作用靶点被发现，这和全球性的肥胖有重要关系。肠道微生物对食物中多糖的加工起着重要作用。我们发现对成年无菌（GF）C57BL/6小鼠用正常饲养动物的盲肠微生物处理过后，在忽略食物摄取的情况下喂养14天，增加了60%的身体脂肪总量和胰岛素耐受性。对无菌小鼠和正常饲养小鼠的研究表明微生物促进了肠道内的单糖吸收，最终诱导了肝脏脂肪的新合成。禁食诱导脂肪细胞因子（Fiaf），一种血管生成素样蛋白，在正常饲养小鼠的肠上皮细胞中被选择性的抑制。对无菌小鼠和正常饲养小鼠，普通小鼠和Fiaf基因敲除小鼠的分析表明，Fiaf是一种循环脂蛋白脂肪酶抑制剂，它的抑制作用对由微生物引发的脂肪细胞中三酸甘油酯的沉积必不可少。对Rag1/动物的研究表明这些宿主反应并不需要成熟的淋巴细胞。我们的发现证明了肠道微生物对宿主从饮食中获取能量起着重要作用。目前世界上有超过5亿人超重，其中有2.5亿人属于肥胖。这种增长的流行病威胁着不管是发达国家还是发展中国家，同时引起了一些并发症，包括II型糖尿病、高血压、心血管疾病和非酒精性脂肪性肝炎。在美国，64%的成年人超重或肥胖，促使卫生局把这种状况看作是如今公众健康最大的威胁。大多数人无法做到终身的、对体重控制有意义的饮食习惯改变。因此，改进食物成分或者发现新的药物作用靶点来减少能量的摄取、吸收和储存对公众的健康有长足的重要性。人类的肠道中含有数量巨大的微生物群。这些群落至少包含着1013个细菌，主要是厌氧菌，大约有5001000个种类，他们总的基因组大概是人类的100倍。我们可以把微生物看作是新陈代谢的器官，这个器官能精确的调控我们的生理机能但是我们自身却没有进化出这个器官。这个器官能处理我们食物中其他难以消化的部分，比如植物多糖。明确微生物控制的信号通路为找到新的作用靶点以促进人类的健康提供了机会。在目前的研究中，我们使用正常小鼠和转基因无菌小鼠来验证一个假设微生物通过一条完整的信号通路来调节宿主的能量储存。材料和方法动物. C57BL/6J (B6)野生型和Rag1-/-小鼠购买自Jackson实验室。B6过氧化物酶体增殖物激活受体（Ppara）-/-小鼠由F. J. Gonzales提供。禁食诱导脂肪细胞因子（Fiaf）+/-杂合子由B6:129/Sv混合产生（在后面描述）。同窝出生的Fiaf+/+、Fiaf+/-、Fiaf-/-小鼠，由Fiaf+/-杂合子杂交得到。动物的基因增殖使用PCR。正常饲养的野生型小鼠（CONVR）和基因敲除小鼠接收时和无菌（GF）小鼠处于相同状态。GF小鼠喂养在无菌隔离器中，并处于严格的12小时循环光照下，同时用高压蒸汽处理的食物喂养，任期自由采食。所有对小鼠的操作都是在华盛顿大学动物委员会规定的条款之下进行。无菌小鼠的养殖. 八周龄的CONVR小鼠的盲肠内容物经过10毫升无菌磷酸盐缓冲液再悬浮后，取2毫升涂抹在7到10周龄GF小鼠的皮毛上。产生的小鼠(CONV-D)在无菌隔离器中饲养1028天，和GF小鼠条件相同。CONVR小鼠饲养在细菌隔离笼中，处于无特定病原体的状态，喂养高压蒸汽处理过的饲料。它们在810周龄的时候被转移到无菌隔离器中饲养2周，以模拟GF和CONVD的生活环境。810周龄的GF小鼠口服移植109个多形拟杆菌VPI-5482。在肠末梢、盲肠、结肠的移植密度为1081011个/mL，由37下于BHI血琼脂中培养的肠腔细菌测得。总脂肪和代谢速率（氧气消耗量）的测量。 小鼠的总脂肪在使用氯胺酮（10mg/kg）和塞拉嗪（10mg/kg）腹腔注射麻醉5分钟后测量。双能X线吸收计量法的操作见文献（9）的描述。氧气消耗量在小鼠意识清醒、自由采食的条件下逐个测量，使用开路间接量热法。小鼠在测量前适应新陈代谢箱20分钟，每次30s，共测1h。以绿色荧光染料为基础的实时的定量反转录酶聚合酶链锁反应（qRT-PCR）。 RNA按照支撑材料描述的方法分离出来，并且通过反转录酶和短dT15引物实现反转录。qRT-PCR实验按照文献10的方法实施，除了25ul的反应包含的cDNA相当于1ng的总RNA和900nM的基因特异性引物。所有的实验都通过ABI棱镜7700序列检测器实施3次。L32 RNA的数据都进行了标准化分析。脂蛋白脂肪酶（LPL）实验 LPL在附睾脂肪组织中的活性通过参考文献11的方法检验。数据统计 统计学上的显著差异使用t检验。超过两组小鼠的数据通过单因素方差分析得到比较。结果和讨论肠道微生物导致成年GF小鼠身体总脂肪含量忽略食物消耗的快速增长的介绍。 810周龄饲养在无菌环境（GF）和出生就生活在微生物环境（CONVR）的雄性B6小鼠的比较显示CONVR多含有42%的身体总脂肪，通过双能X线吸收计量法测得(Fig. 1A)。附睾脂肪的重量也要高47%( Fig. 1B)。一个有趣的现象是，高脂肪含量的CONVR小鼠的饲料(57% 碳水化合物, 5% 脂肪)消耗量比GF小鼠低29%(Fig. 1C)。 810周龄的雄性GF B6小鼠以成年CONVR小鼠肠道末梢（盲肠）的不加分离的微生物处理，正常饲养14天，身体总脂肪上升了57%(Fig. 1A)，附睾脂肪上升了61%( Fig. 1B)。然而去脂体重减少了7%，导致了两组之间总的体重没有明显差别。GF组和CONVD组小鼠禁食后的血清三酸甘油酯水平相近。在一个10天的短期正常饲养中，小鼠的总脂肪含量有相近的增长（66%，与14天比较）。一个28天的长期饲养并没有使身体总脂肪含量和附睾脂肪含量进一步增长。在14天的正常饲养中，脂肪含量的增长却同时伴随着饲料消耗量的减少（比GF低27%，( Fig. 1C）。这些现象并不只是出现在雄性上：CONV-D B6雌性小鼠表现出了85%的总脂肪增长和9%的去脂体重减少，这和相同年龄的雄性小鼠没有显著差异。此外，脂肪储存的表现并不局限于B6近交系小鼠：一次对8周龄NMRI近交系小鼠的常规饲养实验中，其身体总脂肪含量增加了90%，附睾脂肪增加了31%（与GF比较）。对盲肠微生物的基于序列的16S rDNA列举研究表明CONVR组和CONV-D组的主要肠道微生物种类具有高度相似性。在人体中，拟杆菌和梭菌是最普遍的细菌。在人体肠道末梢微生物区中，多形拟杆菌是一类突出的、能捕获和讲解植物多糖的细菌（12）。例如，它的蛋白质组包含172个糖基水解酶，能裂解食物中的大多数的糖苷键。对GF小鼠移植多形拟杆菌的研究表明它的多糖降解作用和诱导宿主单糖转运蛋白有关（13）。因此，我们对8周龄的GF B6小鼠移植了2周的已测序的VPI-5482菌株来明确单一的可分解糖的细菌能否仅通过它自身对宿主的脂肪储存产生影响。VPI-5482菌株的移植对身体总脂肪含量产生了显著性影响，尽管增加的量低于未分离的微生物（分别为23%和57%）。CONVD组的代谢速率高于GF组 微生物对脂肪含量的增长作用并不是因为食物消耗量增加了，开路间接测热法被用来确定是否减少了能量消耗。当我们发现在14天正常饲养后，较瘦的GF小鼠比相同年龄和性别的小鼠代谢速率低27%，这个假设被排除了（Fig. 1D)。耗氧量的增加可以反映宿主的代谢活动或者新植入的微生物群落的代谢活动增加了。没有有效的方法可以测量体内微生物的代谢活动。然而，对冷冻的腓肠肌和肝脏的微量分析的生化试验显示，CONZD组的三羧酸循环中间体高于GF组。除了循环活性增加外，组织中的高能磷酸的含量并没有重大改变。耗氧量的增加而并不伴随高能磷酸储存量的增加，意味着存在一个和生物化学相关的无用的无效新陈代谢循环。瘦素是一种脂肪细胞分泌的荷尔蒙，它的表达和脂肪细胞的脂质含量有关。此外，瘦素还能减少小鼠食物的摄入、增加能量的消耗(Fig. 2A)。它的增加和身体脂肪的增加成比例。脂肪含量的增加伴随着空腹血糖和胰岛素水平的升高(Fig. 2A)，以及葡萄糖耐受性和胰岛素耐受性的增加(Fig. 2 B and C)。微生物促进肝脏产生三酸甘油酯 葡萄糖和胰岛素能诱导肝脏脂肪生成酶的表达。对CONVD小鼠14天的正常饲养使肝脏的三酸甘油酯水平上升了23倍(Fig. 3 A and B)，但是游离脂肪酸和胆固醇并没有变化。qRT-PCR实验表明小鼠肝脏mRNA编码的，和脂肪酸从头合成通路有关的两个关键性酶乙酰辅酶A羧化酶（Acc1）、脂肪酸合成酶（Fas），其水平显著增高(Fig. 3C)。固醇反应元件结合蛋白1(SREBP-1)和碳水化合物反应元件结合蛋白(ChREBP)是两种基本的螺旋-环-螺旋/亮氨酸拉链转录因子，调节肝细胞脂肪对胰岛素和葡萄糖的应答，表现出协同作用。Acc1和Fas都是已知的ChREBP和SREBP-1的靶点。肝脏RNA的qRT-PCR实验表明饲养提高了肝脏的ChREBP mRNA水平，小幅度的提高了SREBP-1的水平(Fig. 3C)。ChREBP被丝氨酸/苏氨酸磷酸酶PP2A脱去磷酸后，从细胞质转移到细胞核。PP2A被5-磷酸木酮糖（Xu5P，磷酸己糖支路的中间体）活化。对小鼠移植了微生物后，肝脏的Xu5P水平相对GF组升高，细胞核中的ChREBP也增加(Fig. 3D)。我们发现了直接的生物化学证据证明微生物的存在促进了肠道中单糖的吸收。GF组小鼠和CONVD组小鼠灌胃了100ul的含有5mM葡萄糖和0.2mM 2-脱氧葡萄糖，15min后处死，测量了它们肠末梢的2-脱氧葡萄糖-6-磷酸的水平，结果显示CONVD组高两倍。一旦进入了小肠，单糖到门脉循环的转移得到了微生物的促进。我们之前的研究证明了CONVD组小肠绒毛上皮组织的毛细血管中2-脱氧葡萄糖-6-磷酸浓度比CONVR组高两倍。微生物通过抑制肠道LPL抑制因子的表达，促进脂肪细胞中三酸甘油酯的储存。GF组和CONV-D组的附睾脂肪组织DNA并没有明显的不同。这个发现，联系到组织化学研究，使我们推断微生物诱发的附睾脂肪组织重量增加是由于脂肪细胞肥大(Fig. 4A)。对脂肪组织的RNA的qRTPCR分析表明脂肪细胞的生物标记(aP2 and PPAR-)和脂质生成(Acc1 and Fas)都没有发生变化(Fig. 4B)。肌肉中的脂蛋白含有大量三酸甘油酯，LPL是一个重要的调节脂蛋白释放脂肪酸的因子。脂肪细胞LPL活性的增加导致了脂肪细胞对脂肪酸摄取的增加和三酸甘油酯的积累。在白色脂肪中，LPL根据营养状况后被转录：禁食减少酶的活性，再投食后又增加酶的活性。有趣的是，在14天的饲养中我们发现附睾脂肪组织的LPL活性增加了122%(Fig. 4C)。而且，这种作用并不仅限于脂肪：酶的活性在心脏中也增加了99%(Fig. 4C)。胰岛素水平的上升使肌肉中LPL的活性降低。因此，我们的发现表明微生物诱导的LPL水平的上升是通过其他的机制。Fiaf是一种已知的血管生成素类蛋白4，由棕色脂肪、白色脂肪、肝脏、肠产生。这种分泌蛋白是一种体外LPL抑制剂IC50 = 200 nM。对刚出生后GF小鼠肠道的Fiaf表达的qRT-PCR实验表明，在哺乳期到断奶期的转换中，小鼠的基因被诱导了。这种诱导并不只出现在GF小鼠上，较低水平的Fiaf mRNA在CONV-R体中发现。在哺乳期到断奶期的转换中，食物从富含脂肪和乳糖的母乳转换为低脂肪和高糖分的饲料，与此同时，微生物从兼性菌转变为专性厌氧菌。这些发现表明Fiaf能提供一个和宿主能量变换有关的信号。qRT-PCR实验表明成年GF小鼠抑制回肠Fiaf的表达，但是并不在肝脏和白色脂肪中产生抑制(Fig. 4D)。随后对激光捕获的微切割的肠腺和肠绒毛上皮细胞、绒毛间质的qRT-PCR研究表明，微生物对Fiaf的抑制发生在已分化的不同的绒毛上皮细胞。综合这些发现，显示出微生物刺激肝脏的三酸甘油酯产生，通过转录因子如ChREBP的调节作用。并促进LPL指导的三酸甘油酯进入脂肪细胞，通过抑制肠道上皮细胞基因编码的LPL抑制因子。我们用没有Fiaf等位基因(Fig. 4E)的来验证这个假设。8周龄雄性GF Fiaf/小鼠比同窝的有Fiaf等位基因的野生型小鼠附睾脂肪组织LPL活性高67%，确定了Fiaf是一个重要的体内脂肪酶抑制因子。在GF基因敲除小鼠的饲养中没有发现其他脂肪组织或心脏中的LPL活性有明显变化。GF Fiaf/小鼠和相同年龄相同性别的CONV-D（Fiaf被抑制）同窝野生型小鼠由等量的身体总脂肪（12.8%和14.2%）。而且，对Fiaf基因缺陷GF小鼠的14天饲养中发现总脂肪量只有少量增长（10%和55% Fig. 4F）。Fiaf+/-杂合子有一个中等量的增长(33%)。这些结果表明了Fiaf在微生物调节周边脂肪的储存中起着重要作用。微生物在Fiaf的表达和脂肪储存中起的作用不依靠成熟的淋巴细胞和PPAR-。在养殖斑马鱼的时候，我们发现斑马鱼和小鼠相当的Fiaf基因被微生物抑制了，说明了这种应答在脊椎动物的进化中被高度保留了。我们用了两种方法来明确这个人类、小鼠、大鼠、斑马鱼和河豚的10kb的DNA序列5到转录起始位点的保守的调节机制。首先，我们用PHYLOCON软件寻找异常的序列。两个显著的序列被发现：一个和PPAR结合位点重叠部分；另一个包含E-box，和Heb结合位点相似。其次，我们用PATSER在TRANSFAC数据库中搜寻了466种特定脊椎动物的转录因子得分矩阵来寻找人和小鼠保守区的5个Fiaf同源基因的高得分结合位点。超过40个矩阵满足这两个选择标准，包含一些由几个钗头函数因子（比如HNF3, HNF4和FKH8）和IFN控制的应答元素确定的位点。Fiaf在筛选肝脏PPAR-因子的时候被辨认出来。PPAR-是一个能量代谢的重要调节因子，存在于一系列组织中，如肠、肝脏、心脏和肾脏。我们发现和GF小鼠相比，CONV-D组小鼠小肠中的PPAR- mRNA水平减少了（1.70.2倍），但是肝脏和脂肪组织中的水平没有变化。为了直接测试PPAR-在微生物引起的脂肪含量改变和Fiaf抑制中起的作用，B6 Ppara基因敲除GF小鼠被繁衍。810周龄雄性Ppara/小鼠与同窝的GF野生型小鼠有相同的总脂肪含量。而且Ppara/小鼠由微生物引起的脂肪含量增加并没有减少。最后，从GF组、CONV-D组野生型和Ppara/小鼠肠道分离的RNA的qRT-PCR实验表明PPAR-基因的缺失不妨碍Fiaf的转录抑制。我们认为宿主脂肪储存对微生物的应答并不需要PPAR-。而可作比较的PPAR-实验没有成功实施，因为Pparg/小鼠在胚胎期10内死亡。根据我们之前的肠组织RNA的GENECHIP分析，在同源Fiaf基因找到了一个保守的IFN（干扰素）刺激的反应元件，表明B6 GF小鼠一些基因表达的调节涉及到B细胞和T细胞的应答。因此，我们繁衍B6 Rag1/ GF小鼠来明确是在成熟T细胞和B细胞存在还是不存在的时候，具有影响微生物增加总脂肪或调节Fiaf的能力。Rag1+/+和Rag1/同窝小鼠在14天的饲养过后有相同的总脂肪增长量（59%和67%），有相似程度的Fiaf抑制（2.8倍和3.8倍）。因此，这些细胞的适应性免疫系统不需要处理信号或者肠道菌群的代谢产物来促进脂肪储存。说明：微生物作为环境因素的影响倾向于肥胖。成年人体内的微生物预计是细胞的10倍。微生物和我们共同进化构成了互利关系。这些关系基于营养的分享。本文的研究内容表明这些共生关系的一个表现形式就是微生物对事物的处理和宿主脂肪组织沉积能量的萃取。这种储存能量的方式有益于古代人类的多变能量摄取。然而，在现代发展社会，食物中存在大量的蛋白质、高热量，这种“有益”变成了损害。 我们对微生物抑制肠组织Fiaf促进肥胖的发现，其机理总结在Fig.5，表明Fiaf表达的增加或者其活性的增加可以促进减肥。我们推测西方饮食习惯引起的微生物生态的改变，或者其中个体的微生物生态的改变，也有可能作为环境因素影响能量的储存以及引起肥胖。专心-专注-专业