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专题专题2 :2 :微生物的培养与应用微生物的培养与应用微生物包括哪五类：微生物包括哪五类：真菌真菌原生动物原生动物 原核生物界原核生物界 原生生物界原生生物界真菌界真菌界病毒界病毒界一、基础知识： (一)微生物：是一切：是一切肉眼肉眼看不见或看不清看不见或看不清楚的微小生物的楚的微小生物的总称总称细菌：细菌：。细胞。细胞，通常，通常用适当染料用适当染料后显微镜观察后显微镜观察C.弧菌：弧菌：霍乱弧菌霍乱弧菌A. 球菌：球菌：金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌 B.杆菌：杆菌：大肠杆菌大肠杆菌单个或少数细菌在单个或少数细菌在上大量繁殖时，就会形成一个上大量繁殖时，就会形成一个肉眼肉眼可见可见的，具有一定形态结构的子的，具有一定形态结构的子细细胞群体胞群体，叫做菌落，叫做菌落。细菌的菌落特征细菌的菌落特征因种而异因种而异，因此，因此菌落菌落是是鉴定鉴定菌种的重要依据。菌种的重要依据。2、细菌的营养类型 自养菌自养菌: : 异养菌异养菌: :腐生菌腐生菌寄生菌寄生菌 大部分病原菌大部分病原菌光合自养型光合自养型:光合细菌光合细菌化能自养型化能自养型:硝化细菌硝化细菌,铁细菌铁细菌,硫细菌硫细菌 有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的的休眠体休眠体，叫做，叫做芽孢芽孢。 特点：特点：1 1、对恶劣的环境，如干旱、高温等，有、对恶劣的环境，如干旱、高温等，有 很强的抵抗力很强的抵抗力 2 2、小而轻，可随风飘散、小而轻，可随风飘散 3 3、当环境适宜（如温度、水分适宜）的条件下，芽、当环境适宜（如温度、水分适宜）的条件下，芽孢又可以萌发，形成一个细菌孢又可以萌发，形成一个细菌. .4、孢子 在生物体的一定部位产生一种特殊的在生物体的一定部位产生一种特殊的生殖细胞生殖细胞叫叫孢孢子子。孢子的。孢子的特点特点是能是能直接直接长成新个体长成新个体 3、真菌、真菌如图是酵母菌电子显微如图是酵母菌电子显微镜下的形态结构镜下的形态结构酵母菌和霉菌酵母菌和霉菌青霉青霉二、培养基二、培养基 培养基（培养液）培养基（培养液）是由人工方法配制而成的，专是由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的营养基质。供微生物生长繁殖使用的营养基质。（3 3）按成分可分为：）按成分可分为：天然培养基天然培养基和和合成培养基合成培养基。1.1.培养基的类型和用途培养基的类型和用途（1 1）按物理状态分：）按物理状态分：固体培养基固体培养基和和液体培养基液体培养基 等等。 （2 2）按功能分可分为：）按功能分可分为：选择培养基选择培养基和和鉴别培养基鉴别培养基。 （1 1）根据培养基的根据培养基的物理性质物理性质分分固体培养基（加入琼脂）固体培养基（加入琼脂） 用于微生物的分离、计数、鉴定用于微生物的分离、计数、鉴定液体培养基（加入琼脂较少）液体培养基（加入琼脂较少） 常用于工业生产常用于工业生产液体培养基的表面生长和均液体培养基的表面生长和均匀混浊生长匀混浊生长固体培养基固体培养基常用的凝固剂常用的凝固剂琼脂琼脂 主要成分是硫酸半乳聚糖主要成分是硫酸半乳聚糖 熔点为熔点为9696 凝固点为凝固点为4040 透明度强。透明度强。1.1.按物理状态分的培养基的用途按物理状态分的培养基的用途液体培养基，不加入琼脂：增菌液体培养基，不加入琼脂：增菌固体培养基，加入琼脂较多：纯化，鉴别固体培养基，加入琼脂较多：纯化，鉴别半固体培养基，加入琼脂较少：保种半固体培养基，加入琼脂较少：保种液体培养基的表面生长液体培养基的表面生长和均匀混浊生长和均匀混浊生长固体培养基固体培养基半固体培养基半固体培养基选择培养基选择培养基在培养基中加入（缺少）某种化学在培养基中加入（缺少）某种化学物质物质,以以抑制抑制不需要的微生物的生长不需要的微生物的生长,促进促进所需要的微所需要的微生物的生长。生物的生长。用以菌种的分离用以菌种的分离 鉴别培养基鉴别培养基在培养基中加入某种在培养基中加入某种指示剂或化学指示剂或化学药品药品。用以菌种的鉴别。用以菌种的鉴别。 （2）.根据培养基的用途分根据培养基的用途分选择培养基加入青霉素的培养基加入青霉素的培养基: : 分离酵母菌、霉菌等真菌分离酵母菌、霉菌等真菌加入高浓度食盐的培养基加入高浓度食盐的培养基: : 分离金黄色葡萄球菌分离金黄色葡萄球菌不加氮源的无氮培养基不加氮源的无氮培养基: : 分离固氮菌分离固氮菌不加含碳有机物的无碳培养基不加含碳有机物的无碳培养基: : 分离自养型微生物分离自养型微生物由已知成分配制而成，培养基由已知成分配制而成，培养基成分明确成分明确 。主。主要成分是要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质盐和其它一些辅助物质。合成培养基合成培养基: :（3 3）天然培养基天然培养基和和合成培养基合成培养基由天然成分配制而成，培养基由天然成分配制而成，培养基成分不明确成分不明确。天。天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡鸡胚和牛胚浸液胚和牛胚浸液）。）。天然培养基天然培养基: :天然培养基和合成培养基的优劣点：天然培养基和合成培养基的优劣点： -天然培养基天然培养基-优点：优点：具有营养丰富、原料易得、配制具有营养丰富、原料易得、配制方便、价格低廉、培养微生物效果好等。方便、价格低廉、培养微生物效果好等。-缺点：缺点：是培养基中营养成分以及微生物是培养基中营养成分以及微生物对各种营养物质的需要量难以确定，实验对各种营养物质的需要量难以确定，实验结果的重复性差。结果的重复性差。-合成培养基合成培养基-优点：优点：营养成分含量准确，因而实验的营养成分含量准确，因而实验的可重复性强。可重复性强。-缺点：缺点：配制烦琐、成本较高、微生物生配制烦琐、成本较高、微生物生长缓慢。长缓慢。 2.培养基的成分培养基的成分 不管哪种培养基，一般都含有不管哪种培养基，一般都含有水水、无机盐无机盐、碳源碳源和和氮源氮源等等营养物质。营养物质。 2.培养基的成分培养基的成分 不管哪种培养基，一般都含有不管哪种培养基，一般都含有水水、无机盐无机盐、碳源碳源和和氮源氮源等等营养物质。营养物质。 另外还需要满足微生物生长对另外还需要满足微生物生长对pHpH、特殊营特殊营养物质养物质, ,例如例如: :生长因子生长因子(即细菌生长必需，而即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物自身不能合成的化合物,如维生素、某些氨基如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶酸、嘌呤、嘧啶) )以及以及氧气氧气、二氧化碳二氧化碳、渗透渗透压压等的要求。等的要求。 3.3.碳源与氮源的比较碳源与氮源的比较 碳源：碳源：是微生物生长所需的是微生物生长所需的含碳含碳化合物。化合物。 氮源：氮源：从外界吸入的从外界吸入的氮素化合物或氮气氮素化合物或氮气。 有的碳源只能是碳源，如有的碳源只能是碳源，如CO2CO2； 有的碳源同时是氮源，如有的碳源同时是氮源，如NH4HCO3NH4HCO3； 有的碳源同时是能源，如有的碳源同时是能源，如葡萄糖葡萄糖； 有的碳源同时也是氮源和能源，如有的碳源同时也是氮源和能源，如蛋白胨蛋白胨； CO2CO2可作为自养型微生物的碳源；可作为自养型微生物的碳源； 硝化细菌能利用硝化细菌能利用NHNH3 3提供能量和氮源。提供能量和氮源。1.1.无菌技术的概念无菌技术的概念 无菌操作泛指在培养微生物的操作中，无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。所有防止杂菌污染的方法。 （1 1）消毒：）消毒：用温和的化学或物理方法，杀死用温和的化学或物理方法，杀死物体表面或内部的物体表面或内部的部份微生物部份微生物的过程。的过程。 2.2.消毒与灭菌的概念及两者的区别消毒与灭菌的概念及两者的区别 （2 2）灭菌：）灭菌：以强烈的理化因素杀死物体内外以强烈的理化因素杀死物体内外所有微生物所有微生物，达到，达到完全无菌完全无菌的过程。的过程。 灭菌与消毒技术是微生物有关工作中灭菌与消毒技术是微生物有关工作中最最普通也是最重要的技术普通也是最重要的技术。1 1、煮沸消毒法煮沸消毒法:100100煮沸煮沸5-6min5-6min2、巴氏消毒法：、巴氏消毒法：70-75 70-75 下煮下煮30min30min或或 80 80 下煮下煮15min15min3、化学药剂消毒法、化学药剂消毒法:用用75%75%酒精、新洁酒精、新洁 尔灭等进行皮肤消毒尔灭等进行皮肤消毒; ;氯气消毒水源氯气消毒水源4、紫外线消毒：、紫外线消毒：对实验室空气消毒对实验室空气消毒(1)消毒的方法：消毒的方法：3.3.常用的消毒与灭菌的方法常用的消毒与灭菌的方法1 1、干热灭菌：、干热灭菌：160-170160-170下加热下加热1-2h1-2h。(2)灭菌的方法：灭菌的方法：适用适用于于玻璃器皿玻璃器皿( (如试如试管、平皿、吸管、注射管、平皿、吸管、注射器器) )和和金属器具金属器具( (如针头、如针头、摄子、剪刀等摄子、剪刀等) )的灭菌。的灭菌。2 2、高压蒸气灭菌：、高压蒸气灭菌：100kPa100kPa、121 121 下维持下维持15-30min.15-30min. (2)灭菌的方法：灭菌的方法： 最常用的灭菌方法最常用的灭菌方法是是高高压蒸汽灭菌压蒸汽灭菌，它可以杀，它可以杀灭所有的生物，包括最灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休耐热的某些微生物的休眠体，眠体，同时可以基本保同时可以基本保持培养基的营养成分不持培养基的营养成分不被破坏。被破坏。3 3、灼烧灭菌：、灼烧灭菌：微生物学实验室的接种环、微生物学实验室的接种环、接接种种针、试管口等的灭菌针、试管口等的灭菌(2)灭菌的方法：灭菌的方法：比较比较项目项目理化因素理化因素作用强度作用强度消灭微生物消灭微生物的数量的数量芽孢和孢子能否芽孢和孢子能否被消灭被消灭消毒消毒灭菌灭菌列表比较消毒与灭菌列表比较消毒与灭菌较为温和较为温和强强 烈烈能能不能不能部分生活状部分生活状态的微生物态的微生物全部微生物全部微生物1.1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？被其他外来微生物污染外，还有什么目的？2.2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。菌。如果需要，请选择合适的方法。（1 1） 培养细菌用的培养基与培养皿培养细菌用的培养基与培养皿（2 2） 玻棒、试管、烧瓶和吸管玻棒、试管、烧瓶和吸管（3 3） 实验操作者的双手实验操作者的双手 答：无菌技术还能有效避免操作者自答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。身被微生物感染。答：（答：（1）、（）、（2）需要灭菌；（）需要灭菌；（3）需要消毒）需要消毒。1 1计算：计算：根据配方比例，计算根据配方比例，计算100mL100mL培养培养基各成分用量。基各成分用量。2.2.称量：称量：准确称取各成分。称取牛肉膏和蛋准确称取各成分。称取牛肉膏和蛋白胨时动作要迅速，目的是防止牛肉膏吸收白胨时动作要迅速，目的是防止牛肉膏吸收空气中水分空气中水分。 3 3溶化：溶化：加水加热熔化牛肉膏；加入加水加热熔化牛肉膏；加入蛋白胨和氯化钠继续加热；加入琼脂；蛋白胨和氯化钠继续加热；加入琼脂；用蒸馏水定容到用蒸馏水定容到100mL100mL。整个过程不断用玻。整个过程不断用玻棒搅拌，目的是防止琼脂糊底而导致烧杯破棒搅拌，目的是防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。裂。三、实验操作步骤三、实验操作步骤4调调pH：用用1mol/LNaOH溶液调节溶液调节pH至偏碱至偏碱性（性（ pH76）5 5灭菌灭菌: :将配置好的将配置好的培养基培养基用玻棒转移至三角用玻棒转移至三角锥瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮纸，再放入高锥瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮纸，再放入高压蒸气灭菌锅，在压力为压蒸气灭菌锅，在压力为100100kPakPa、温度为温度为121121，灭菌，灭菌15153030minmin。将将培养皿培养皿用旧报用旧报纸包裹，放入干热灭菌箱内，在纸包裹，放入干热灭菌箱内，在160160170 170 下灭菌下灭菌2 2h h。6 6倒平板倒平板: :待培养基冷却到待培养基冷却到5050左右时，在左右时，在酒精灯附近倒平板酒精灯附近倒平板。（倒平板操作见课本）。（倒平板操作见课本）2 2d d后观察平板，无杂菌污染才可用来接种。后观察平板，无杂菌污染才可用来接种。1.1.培养基灭菌后，需要冷却到培养基灭菌后，需要冷却到5050左右时，才左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？度？ 答：答：可以用手触摸盛有培养基的锥形可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。时，就可以进行倒平板了。2.2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？ 答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。污染培养基。3.3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？平板冷凝后，为什么要将平板倒置？4.4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？培养微生物吗？为什么？答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。微生物。四、纯化大肠杆菌四、纯化大肠杆菌接种方法有：接种方法有：平板划线法和稀释涂布平板法平板划线法和稀释涂布平板法平板划线法平板划线法: :通过接种环在琼脂固体培养基通过接种环在琼脂固体培养基表面连续画线的操作表面连续画线的操作, ,将聚集的菌种逐步稀将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面释分散到培养基的表面. .一旦划破，会造成划线不均匀，难一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；以达到分离单菌落的目的；二是存留在划破处的单个细胞无法二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。处生长，会形成一个条状的菌落。 1.1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？要灼烧接种环吗？为什么？ 操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。染操作者。2.2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？再进行划线？以免接种环温度太高，杀死菌种。以免接种环温度太高，杀死菌种。3.3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线么总是从上一次划线的末端开始划线？ 划线后，线条末端细菌的数目比线条起始划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。 涂布平板的所有操作都应在火焰附近涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第操作要求，想一想，第2 2步应如何进行无步应如何进行无菌操作？菌操作？ 应从操作的各个细节保证应从操作的各个细节保证“无菌无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等。在酒精灯火焰周围等。四、课题成果评价四、课题成果评价 （一）培养基的制作是否合格（一）培养基的制作是否合格 如果未接种的培养基在恒温箱中保温如果未接种的培养基在恒温箱中保温1 12d2d后无后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。制备。 （二）接种操作是否符合无菌要求（二）接种操作是否符合无菌要求 如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本本一致一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。再次练习。 （三）是否进行了及时细致的观察与记录（三）是否进行了及时细致的观察与记录 培养培养12h12h与与24h24h后的大肠杆菌菌落的大小会有明后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同，并能观察到其他一些细微的变化。这一步的要显不同，并能观察到其他一些细微的变化。这一步的要求主要是培养学生良好的科学态度与习惯。求主要是培养学生良好的科学态度与习惯。 1 1、临时保藏：、临时保藏：接种到固体斜面培接种到固体斜面培养基，菌落长成后养基，菌落长成后置于置于44冰箱保存。冰箱保存。 2 2、长期保存：、长期保存：甘油冷冻管藏法甘油冷冻管藏法本课题知识小结本课题知识小结: : 1.1.筛筛选原理：选原理：人为提供有利于人为提供有利于目的菌株目的菌株生长生长的条件的条件( (包括营养、温度、包括营养、温度、pHpH等等) )，同时抑制或，同时抑制或阻止其他微生物生阻止其他微生物生长。长。一一.研究思路研究思路. .筛选菌株：筛选菌株： 2. 2.分离方法：分离方法：根据微生物的特点，包括营养、根据微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等，采用生理、生长条件等，采用选择培养选择培养的分离方法，的分离方法，或抑或抑制使大多数微生物不能生长，或造成有利于该菌生长制使大多数微生物不能生长，或造成有利于该菌生长的环境的环境，经过一定时间培养后使该菌在群落中的数量，经过一定时间培养后使该菌在群落中的数量上升，再通过上升，再通过平板稀释平板稀释等方法对它进行纯培养分离。等方法对它进行纯培养分离。. .统计菌落数目：统计菌落数目：1.1.直接计数法：直接计数法：这种方法是利用特定这种方法是利用特定细菌计数板或细菌计数板或血细胞计数板血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。生物的数量。此法的缺点是不能区分死菌和活菌。此法的缺点是不能区分死菌和活菌。2.2.间接计数法间接计数法( (活菌计数法活菌计数法) )：原理：原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。常用方法：常用方法：稀释涂布平板法。稀释涂布平板法。每克样品中的菌落数每克样品中的菌落数(C(CV)V)M M其中，其中，C C代表某一稀释度下平板上生长的平代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，均菌落数，V V代表涂布平板时所用的稀释液代表涂布平板时所用的稀释液的体积的体积(ml)(ml)，M M代表稀释倍数。代表稀释倍数。注意事项注意事项为了保证结果准确，一般选择菌落数在为了保证结果准确，一般选择菌落数在3030300300的平板上进行计数。的平板上进行计数。为使结果接近真实值可将为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出，经涂布，培养计算出菌落平均数。菌落平均数。统计的菌落往往比活菌的实际数目统计的菌落往往比活菌的实际数目低。低。3 3、滤膜法滤膜法: :膜膜过滤法是当样品中菌数很低时，过滤法是当样品中菌数很低时，可以将一定体积的湖水、海水或饮用水等样品可以将一定体积的湖水、海水或饮用水等样品通过膜过滤器。然后将滤膜干燥、染色，并经通过膜过滤器。然后将滤膜干燥、染色，并经处理使膜透明，再在显微镜下计算膜上处理使膜透明，再在显微镜下计算膜上( (或一定或一定面积中面积中) )的细的细菌数菌数实例分析启示：实例分析启示：在设计实验时，一定要至少涂布三个平板，作为在设计实验时，一定要至少涂布三个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。在分重复组，才能增强实验的说服力与准确性。在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。要重新实验。. .设置对照：设置对照： 什么是对照试验？什么是对照试验？ 设设置对照的主要目置对照的主要目的是？的是？ P23P23讨论问题讨论问题 A A同学的结果与其他同学不同，可能的解同学的结果与其他同学不同，可能的解释有两种。释有两种。一是由于土样不同，二是由于培一是由于土样不同，二是由于培养基污染或操作失养基污染或操作失误。误。 1. 1.方案一：可方案一：可以由其他同学用与以由其他同学用与A A同学一样的土同学一样的土样进行实验，样进行实验，如果结果与如果结果与A A同学一致，则证明同学一致，则证明A A无误；无误；如果结果不同，则证明如果结果不同，则证明A A同学存在操作失误或培养基同学存在操作失误或培养基的配制有问的配制有问题。题。 2.方案二：方案二：将将A A同学配制的培养基在不加土样的同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是以证明培养基是否受到污否受到污染。染。 二二. .实实验设计验设计 . .土壤取样土壤取样 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土土3cm3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。信封中。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。前都要灭菌。. .制备培养基：制备培养基：制备以制备以尿素尿素为唯一氮源的为唯一氮源的选择培养基选择培养基。. .样品的稀释：样品的稀释：应在应在火焰旁火焰旁称取称取土壤土壤在稀释土壤溶液的过程中，在稀释土壤溶液的过程中，每一步每一步都要在都要在火焰旁火焰旁进行。进行。分离不同的微生物采用不同的稀释度分离不同的微生物采用不同的稀释度，其，其原因原因是不是不同微生物在土壤中含量不同，同微生物在土壤中含量不同，其目的是保证获得菌落其目的是保证获得菌落数在数在3030300300之间、适于计数的平板。之间、适于计数的平板。细菌稀释度为细菌稀释度为10104 4、10105 5、10106 6，放线菌稀释度为，放线菌稀释度为10103 3、10104 4、10105 5，真菌稀释度，真菌稀释度为为10102 2、10103 3、10104 4。. .取样涂布取样涂布实验时实验时要对培养要对培养皿作好标皿作好标记。记。注明注明培养基类培养基类型、培养型、培养时间、稀时间、稀释度、培释度、培养物等。养物等。 如如果得到了果得到了2 2个或个或2 2个以上菌落数目个以上菌落数目在在3030030300的平的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。表明试验不精确，需要重新实验。. .微生物的培养与观察微生物的培养与观察 在菌落计数时，每隔在菌落计数时，每隔24h24h统计一次菌落数目。统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。 培养不同微生物往往需要不同培养温度。培养不同微生物往往需要不同培养温度。细菌一般在细菌一般在30303737培养培养1 12d2d，放线菌一般在，放线菌一般在25252828培养培养5 57d7d，霉菌一般在，霉菌一般在25252828的温的温度下培养度下培养3 34d4d。思考与讨论思考与讨论菌菌种鉴定的依据是什种鉴定的依据是什么？么？ 不不同种类的细菌形成的菌落，在大小、形同种类的细菌形成的菌落，在大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等方面具有状、光泽度、颜色、硬度、透明度等方面具有一度的特征，一度的特征，菌落特征可作为菌种鉴定的重要菌落特征可作为菌种鉴定的重要依据。依据。三三. .结果分析与评价结果分析与评价1.1.通过对照实验，若培养物有通过对照实验，若培养物有杂菌污染杂菌污染，菌落数菌落数偏高偏高；若培养物；若培养物混入其他氮源混入其他氮源，则，则菌落形态多样菌落形态多样，菌落数偏高菌落数偏高，难以选择出，难以选择出分解尿素的微生物。分解尿素的微生物。2.2.选选择每个平板上长择每个平板上长有有3030030300个菌落的个菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。同一稀释倍计算每克样品的菌数最合适。同一稀释倍数的三个重复的稀释倍数的三个重复的菌落数不能相差悬菌落数不能相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。殊，如相差较大，表示实验不精确。四四. .课外延伸课外延伸 在以在以尿素为唯一氮源尿素为唯一氮源的培养基中加的培养基中加入入酚红酚红指示剂。培养某种细菌后，如果指示剂。培养某种细菌后，如果PHPH升高，指示剂将变红，说明该细菌能升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。够分解尿素。专题专题2 :2 :微生物的培养与应用微生物的培养与应用1 1、纤维素酶、纤维素酶水解纤维素生成水解纤维素生成纤维二糖纤维二糖和和葡萄糖葡萄糖的一类酶的总称的一类酶的总称定义定义纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即包括三种组分，即C C1 1酶酶( (外切酶外切酶) )、C CX X酶酶( (内切酶内切酶) )和和葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成，前两种酶使纤维素分解成纤维纤维二糖二糖，第三种酶将，第三种酶将纤维二糖纤维二糖分解成分解成葡萄糖葡萄糖。纤维二糖纤维二糖C C1 1酶、酶、CxCx酶酶葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶葡萄糖葡萄糖纤维素纤维素组分组分细菌细菌的纤维素酶位于的纤维素酶位于细胞膜上，真菌和放线菌细胞膜上，真菌和放线菌的的纤维素酶是纤维素酶是胞外酶，胞外酶，即分泌到生产菌胞外的酶即分泌到生产菌胞外的酶纤维素酶的分布纤维素酶的分布A A、人能不能对纤维素消化吸收？为什么？人能不能对纤维素消化吸收？为什么？不能，因为人体不能合成纤维素酶。人以淀粉不能，因为人体不能合成纤维素酶。人以淀粉为主要的能量来源。为主要的能量来源。思考：思考：B B、食物中的纤维素有什么作用？食物中的纤维素有什么作用？食物中的膳食纤维可刺激胃肠蠕动和分泌消化食物中的膳食纤维可刺激胃肠蠕动和分泌消化液，有助于食物的消化和排泄。液，有助于食物的消化和排泄。C C、反刍动物能利用纤维素吗？为什么？反刍动物能利用纤维素吗？为什么？能，在反刍动物的瘤胃中生活着大量可以分解能，在反刍动物的瘤胃中生活着大量可以分解纤维素的微生物，能产生大量的纤维素酶纤维素的微生物，能产生大量的纤维素酶2 2、纤维素的分解、纤维素的分解细菌如：纤维杆菌、纤维弧菌、纤维球菌等细菌如：纤维杆菌、纤维弧菌、纤维球菌等真菌如：木霉、青霉、根霉、黑曲霉等真菌如：木霉、青霉、根霉、黑曲霉等能分解纤维素的微生物有各种能分解纤维素的微生物有各种细菌、真菌和少细菌、真菌和少数放线菌。数放线菌。种类种类二、纤维素分解菌的筛选二、纤维素分解菌的筛选刚果红（刚果红（CRCR）是一种染料，它可以与象纤维素是一种染料，它可以与象纤维素这样的这样的多糖物质多糖物质形成红色复合物，但并形成红色复合物，但并不和不和水水解后的解后的纤维二糖和葡萄糖纤维二糖和葡萄糖发生这种反应发生这种反应刚果红染色法刚果红染色法：这种方法能够通过颜色反应：这种方法能够通过颜色反应直接直接 对微生物进行筛选对微生物进行筛选 纤维素被分解纤维素被分解纤维素纤维素富含纤维素的环境中富含纤维素的环境中由于生物与环境的相互依存关系，在富含纤由于生物与环境的相互依存关系，在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对提维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土样中获得目的微生物的几高，因此从这种土样中获得目的微生物的几率要高于普通环境。率要高于普通环境。目的：目的：增加纤维素分解菌的浓度，以确保能增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离所需要的微生物够从样品中分离所需要的微生物液体培养基，因培养基中无凝固剂，利用液体液体培养基，因培养基中无凝固剂，利用液体培养基培养以增加纤维素分解菌的浓度培养基培养以增加纤维素分解菌的浓度B B、培养基具有选择作用的原因培养基具有选择作用的原因能够产生纤维素酶的微生物才能分解纤维素作能够产生纤维素酶的微生物才能分解纤维素作为碳源和能源，并大量繁殖；不能分解纤维素为碳源和能源，并大量繁殖；不能分解纤维素的微生物由于缺乏碳源受到抑制而不能正常生的微生物由于缺乏碳源受到抑制而不能正常生长繁殖，因此培养基具有选择作用长繁殖，因此培养基具有选择作用A A、物理性质上看培养基的类型及原因物理性质上看培养基的类型及原因C C、为什么选择培养能够、为什么选择培养能够“浓缩浓缩”所需的微生物？所需的微生物？在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速的繁殖。而那些不适营养条件的微生物得到迅速的繁殖。而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到浓缩的作用。以起到浓缩的作用。（3 3）梯度稀释）梯度稀释（4 4）涂布培养）涂布培养每个稀释度下需涂布每个稀释度下需涂布3 3个平板个平板 按照课题按照课题1的稀释操作方法，将选择培养后的的稀释操作方法，将选择培养后的培养基进行等比稀释培养基进行等比稀释1 1、刚果红染色法、刚果红染色法: :（5 5）筛选菌株：）筛选菌株：方法一：方法一：先培养微生物，先培养微生物，在长出菌落的培养在长出菌落的培养基上基上，再加入刚果红进行颜色反应，再加入刚果红进行颜色反应方法二：方法二：在倒平板时，在倒平板时，先先把培养基中其它成分把培养基中其它成分灭灭菌后菌后，加入刚果红，加入刚果红四、结果分析与评价四、结果分析与评价（一）培养基的制作是否合格以及选择培养基是一）培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选出菌落否筛选出菌落（二）分离的结果是否一致（二）分离的结果是否一致 设置对照，若对照的培养基在培养过设置对照，若对照的培养基在培养过程中无菌落生长则说明培养基制作合格。程中无菌落生长则说明培养基制作合格。如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。能获得了分解纤维素的微生物。液体发酵、固体发酵两种液体发酵、固体发酵两种1 1、固体发酵：指微生物在、固体发酵：指微生物在没有或几乎没有或几乎没有游离没有游离水的固态的湿培养基上发酵的过程。水的固态的湿培养基上发酵的过程。2 2、液体发酵：呈、液体发酵：呈液体液体的微生物发酵过程的微生物发酵过程现代微生物工业多为液体发酵现代微生物工业多为液体发酵3 3、纤维素酶的测定、纤维素酶的测定一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的生的葡萄糖葡萄糖进行定量的测定进行定量的测定
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