三七不同药用部位有效成分含量测定

三七不同药用部位有效成分含量测定崔翰明 林海 路文龙 程慧平 张春光 王阶*中国中医科学院广安门医院（北京市宣武区北线阁5号，100053）摘要：目的 建立三七不同药用部位中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re和Rb1的HPLC含量测定方法，比较三七不同药用部位中上述4种皂苷的含量。方法 三七不同药用部位（主根、筋条、剪口、叶、花）甲醇提取，RP-HPLC/UV法测定，Kromasil C18（2504.6mm，5m）色谱柱；以不同比例乙腈和水（v/v）线性梯度洗脱；流速：1mLmin-1；柱温：30；检测波长：203nm；进样量：10L。结果 三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re和Rb1可达到基线分离，其中人参皂苷Rg1和Re的分离度大于1.5；三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re和Rb1的线性范围分别为：4.4-440gmL-1，4.32-1080gmL-1， 4.24-212gmL-1和4.48-1120gmL-1；4种皂苷的精密度和日间差RSD（n5）分别为0.46，0.24，0.77，0.68和1.64，0.69，0.52，0.65；加样回收率分别为103.261.22，103.180.49，103.201.58，103.860.39；三七不同药用部位含上述4种皂苷总量的顺序为剪口主根筋条叶花；而三七主根含上述4种皂苷总量的顺序为60头80头40头20头100头。结论 本方法简便、灵敏、准确，重现性良好，可用于准确分析三七不同药用部位中上述4种皂苷的含量。关键词：三七；三七皂苷；高效液相色谱；含量测定Abstract: Objective: A quantitative method was developed by gradient elution for the determination of notoginsenoside R1, ginsenoside Rg1, ginsenoside Re and ginsenoside Rb1 in different position of Radix Notoginseng by HPLC. The content of 4 kinds saponins in different position of Radix Notoginseng was compared. Method: The different position of Radix Notoginseng (including root, rhizome, branch root, leaf, flower) were extracted with methanol. The HPLC conditions include Kromasil C18column (2504.6mm，5m), different proportion acetonitrile and water linearity gradient elution, flow rate at 1.0mLmin-1, column temperature at 30, wavelength 203nm. Result: The linear ranges of notoginsenoside R1, ginsenoside Rg1, ginsenoside Re and ginsenoside Rb1 were 4.4-440gmL-1, 4.32-1080gmL-1, 4.24-212gmL-1 and 4.48-1120gmL-1, respectively. 4种皂苷的精密度和日间差RSD（n5）分别为0.46，0.24，0.77，0.68和1.64，0.69，0.52，0.65；加样回收率分别为103.261.22，103.180.49，103.201.58，103.860.39；三七不同药用部位含上述4种皂苷总量的顺序为剪口主根筋条叶花；而三七主根含上述4种皂苷总量的顺序为80头60头20头40头100头。结论 本方法简便、灵敏、准确，重现性良好，可用于准确分析三七不同药用部位中上述4种皂苷的含量。Conclusion: The method was simple, sensitive, accurate and repeat, and was suitable in determination of the content of 4 kinds saponins in different position of Radix Notoginseng.method was sampa To structure.三七为五加科Araliaceae人参属Panax植物三七Panax notoginsng (Burk) F.H.Chen。主产于我国云南、广西等省，为我国特产的传统珍贵药材。三七的主要有效成分为三七皂苷，其中含量较高的有三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd和Rf等14。目前，市场上商品三七的规格品种多样，质量不一。05版药典规定三七为其原植物的根和根茎，其中主根为临床所用三七，支根习称筋条，根茎习称剪口。三七总皂苷提取物生产厂家常用三七剪口或筋条为原料，民间也有使用三七叶和花。而不同的三七药用部位其主要皂苷类成分的含量差别较大。因此，建立一种测定三七不同药用部位中主要皂苷类成分（三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re和Rb1）含量的方法，并比较不同药用部位和不同规格三七中上述4种皂苷的含量具有重要意义。1. 仪器与试药德国Knaver二元高压泵、Knaver UV Detecter；Kromasil C18色谱柱（2504.6mm，5m，100）。三七主根（20-100头）、筋条（侧根）、剪口（根茎）、叶、花均购自云南文山；三七对照药材、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re和Rb1对照品均购自中国药品生物制品检定所；甲醇、乙腈（Fisher制剂公司），高纯水（Milliq超纯水机）。2. 方法与结果2.1 色谱条件色谱柱：Kromasil C18色谱柱（2504.6mm，5m，100）；流动相：乙腈（A）水（B）线性梯度洗脱（v/v），比例见表1；流速：1mLmin-1；柱温：30；检测波长：203nm。进样量：10L。表1：乙腈（A）水（B）流动相梯度表（v/v）时间0min13min30min35min40min乙腈（A）20%20%25%40%20%水（B）80%80%75%60%80%2.2 供试品溶液的制备参考药典方法5，分别取三七主根（20、40、60、80、100头）、三七筋条（侧根）、三七剪口（根茎）、三七叶、三七花粉末（过四号筛）0.6g，精密称定，分别精密加入甲醇50mL，称定重量，放置12小时，置于80水浴中保持微沸2h，放冷，称重，用甲醇补足损失的重量，摇匀，0.45m滤芯过滤，取续滤液作为供试品溶液。分别取上述不同供试品溶液10L进样，按照2.1色谱条件测定，记录色谱图。其结果见图1。AB图1. 三七HPLC图谱。A.混合对照品色谱图；B. 三七主根色谱图（图中1为三七皂苷R1、2为人参皂苷Rg1、3为人参皂苷Re、4为人参皂苷Rb1）。由上图可见各峰可达到基线分离，其中难分离的人参皂苷Rg1和Re的分离度为1.75，大于05版药典定量要求的1.5。2.3 线性范围和标准曲线分别精密称取三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re和Rb1对照品适量，用甲醇将其配制成一定浓度的溶液，分别精密量取一定量，用甲醇稀释成适宜浓度的系列溶液，即得对照品溶液。分别取上述对照品溶液10L进样，按2.1色谱条件测定，记录色谱图。以对照品浓度C（gmL-1）和色谱峰面积A作线性回归得标准曲线，其中三七皂苷R1的标准曲线方程为A2.5159C-0.9402，R20.9999，线性范围为4.4-440gmL-1；人参皂苷Rg1的标准曲线方程为A2.914C-2.5983，R21，线性范围为4.32-1080gmL-1；人参皂苷Re的标准曲线方程为A2.8113C+1.9988，R20.9999，线性范围为4.24-212gmL-1；人参皂苷Rb1的标准曲线方程为A2.347C-0.4003，R20.9999，线性范围为4.48-1120gmL-1。2.4 最低检测限和定量限考察将对照品溶液进行稀释，以信噪比（S/N）3，确定其最低检测限，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1的最低检测限分别为：1.32，1.29，1.27，0.67gmL-1。以信噪比（S/N）10，确定其最低定量限，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1的最低定量限分别为：4.4，4.32，4.24，2.24gmL-1。2.5 精密度和稳定性试验取浓度为110gmL-1的三七皂苷R1，540gmL-1人参皂苷Rg1，560gmL-1人参皂苷Rb1，42.4gmL-1人参皂苷Re对照品溶液，分别连续进样10L，按2.1色谱条件重复测定5次，记录色谱图。根据峰面积按各自的线性方程计算浓度，以计算浓度与配制浓度之比为回收率和精密度，并求RSD。结果见表2。表2. 测定方法的精密度和回收率（n=5）样品三七皂苷R1人参皂苷Rg1人参皂苷Re人参皂苷Rb1配制浓度110gmL-1540gmL-142.4gmL-1560gmL-1计算浓度110.180.51540.031.3041.900.32563.473.83回收率（）100.160.46100.000.2498.810.76100.620.68精密度（RSD）0.460.240.770.68取浓度为110gmL-1的三七皂苷R1，540gmL-1人参皂苷Rg1，560gmL-1人参皂苷Rb1，42.4gmL-1人参皂苷Re对照品溶液，分别在放置0、1、2、5、7d后按照2.1色谱条件测定，记录色谱图。根据峰面积按各自的线性方程计算浓度，以计算浓度与配制浓度之比为回收率和精密度，并求日间差。结果见表3。表3. 测定方法的日间差（n=5）样品三七皂苷R1人参皂苷Rg1人参皂苷Re人参皂苷Rb1配制浓度110gmL-1540gmL-142.4gmL-1560gmL-1计算浓度108.271.77534.763.6842.080.22559.123.66回收率（）98.421.6199.030.6899.250.5299.840.65日间差（RSD）1.640.690.520.652.6 加样回收率试验取已知浓度的三七供试液1mL，分别精密加入浓度为110gmL-1的三七皂苷R1、216gmL-1人参皂苷Rg1、112gmL-1人参皂苷Rb1和42.4gmL-1人参皂苷Re对照品溶液1mL，用甲醇定容至5mL。按2.1色谱条件重复测定5次，记录色谱图。根据峰面积按各自的线性方程计算浓度，以计算浓度与配制浓度之比为回收率和精密度，并求RSD。结果见表4。表4. 加样回收率（n=5）样品三七皂苷R1人参皂苷Rg1人参皂苷Re人参皂苷Rb1供试液含量270.14g462.10g175.62g534.78g加样量110g216g42.4g112g配制浓度76.03gmL-1283.05gmL-143.60gmL-1310.34gmL-1计算浓度78.500.93292.051.3845.000.69322.321.21回收率（）103.261.22103.180.49103.201.58103.860.39RSD1.180.471.530.382.7 重现性试验精密称取三七主根（20头）0.6g，按2.2供试品溶液的制备方法制备6份样品，分别取10L进样，按照2.1色谱条件测定，记录色谱图。根据峰面积按各自的线性方程分别计算三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1的含量，并求6次测定的RSD。结果见表5。表5. 重现性（n=6）取样量（g）三七皂苷R1含量（mg/g）人参皂苷Rg1含量（mg/g）人参皂苷Re含量（mg/g）人参皂苷Rb1含量（mg/g）0.60627.4934.983.8449.380.60857.3834.473.9149.660.60497.4234.563.9349.640.60607.3934.393.8249.020.60687.3634.183.8548.860.63607.5034.763.9750.76meanSD7.420.00434.550.083.890.00349.550.45RSD0.050.230.090.922.8 不同药用部位和不同规格三七的测定分别取不同药用部位和不同规格三七供试品溶液10L进样，按照2.1色谱条件测定，记录色谱图。根据峰面积按各自的线性方程计算三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Rb1和Re的含量，结果见表6和图3。表6. 不同药用部位和不同规格三七中4种皂苷含量样品三七皂苷R1含量（mg/g）人参皂苷Rg1含量（mg/g）人参皂苷Re含量（mg/g）人参皂苷Rb1含量（mg/g）4种皂苷总量（mg/g）20头三七7.5234.763.9750.7697.0240头三七8.1335.745.1041.3790.3460头三七8.7243.112.4261.20115.4580头三七19.1746.246.3748.74120.52100头三七7.6132.333.3346.7990.06三七筋条10.8033.153.3838.2685.60三七剪口19.3546.578.3755.52129.82三七叶0.170.800.076.787.82三七花1.700.170.0218.2620.15图2. 不同药用部位和不同规格三七中4种皂苷的含量由表6和图3可见，三七不同药用部位含上述4种皂苷总量的顺序为剪口主根筋条花叶；而三七主根含上述四种皂苷总量的顺序为80头60头20头40头100头。3 讨论按照2005版中国药典三七项下的色谱条件无法分离人参皂苷Rg1和Re，而人参和西洋参项下的色谱条件虽然可以将Rg1和Re分离，但所需分析时间均达到100min。我们在药典三七项下的色谱条件基础上，以人参皂苷Rg1和Re分离度为目标，经系统优化后将HPLC方法定为2.1的色谱条件。此方法能很好的分离三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re和Rb1，其中难分离的人参皂苷Rg1和Re可达到基线分离，其分离度达到1.75。经方法学考察三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re和Rb1在较宽的范围内线性良好；4种皂苷的精密度和日间差RSD（n5）均小于2，回收率在98104之间，测定重现性RSD小于1。文献关于三七中皂苷类成分的HPLC测定方法较多，但基本上均为测定三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和Rb13种皂苷，未能将人参皂苷Rg1和Re分离6-8。仅有少数几篇文献测定了4种以上的皂苷，但所用方法均较复杂耗时长9。本方法采用甲醇提取直接进样，在45min内即可完成测定，具有简便、灵敏、准确，重现性良好等优点，可用于准确分析三七不同药用部位中上述4种皂苷的含量。皂苷类成分因无发色团，仅有末端紫外吸收。文献中有用蒸发光散射（ELSD）检测器测定三七皂苷，实验中发现ELSD在梯度洗脱时能提供优于紫外检测器的基线，但检测限和定量限较UV法差，线性范围也较窄，因此选择203nm紫外检测。实验测定三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1的最低检测限分别为：1.32，1.29，1.27，0.67gmL-1；最低定量限分别为：4.4，4.32，4.24，2.24gmL-1。经测定三七不同药用部位含上述4种皂苷总量的顺序为剪口主根筋条叶花，证明厂家采用三七剪口和筋条提取三七总皂苷具有一定合理性，可提高药材使用率，节约经费。实验测定三七主根含上述4种皂苷总量的顺序为80头60头20头40头100头，经请教文山GAP基地，不同头数三七与三七生长年限有关，说明三七不同生长年限对上述4种皂苷的总量有较大影响，具体多少年生三七中上述4种皂苷总量更高还需进一步测定。