IBA NAA 光质对匍枝筋骨草生长及β蜕皮甾酮含量的影响

东北林业大学硕士学位论文IBA、NAA、光质对匍枝筋骨草生长及蜕皮甾酮含量的影响姓名：赵晓杰申请学位级别：硕士专业：森林生物工程指导教师：迟德富202106摘要摘要匍枝筋骨草(Ajuga lobata)是唇形科筋骨草属多年生草本植物，研究发现，其中的甾 酮类化合物的13蜕皮甾酮能够促进昆虫的蜕皮和变态，可作为新型无公害杀虫剂开发利 用。为了保护匍枝筋骨草自然资源，维护生态环境，实现匍枝筋骨草资源的可持续利用开展 和满足人们的需求，通过应用现代生物技术，利用组织培养的方式来生产匍枝筋骨草，并通过改善环境条件来提高次生代谢产物含量具有重要的实际应用价值。本论文以匍枝筋骨草为 研究对象，开展了以下几方面的研究： 1用匍枝筋骨草叶片培养获得了组培苗，建立起了良好的扩繁体系。结果说明，采用匍枝筋 骨草嫩叶为外植体，3NaClO处理10 min可到达较好的消毒效果。诱导不定芽增值的最适 培养基为MS+6BA 1 mgL，增殖率高；诱导愈伤的最适培养基为MS+6-BA 1 mgL+2，4-D 04 mgL，所得愈伤组织大而绿，长势良好；诱导生根的最适培养基是MS+IBA 1 mgL，所 得根系兴旺，植株健壮。本实验建立了完整的匍枝筋骨草植株再生体系，为匍枝筋骨草的大规模生产奠定了根底。2本实验研究了以喷施清水为对照，采用IBA(05 mgL，1 mgL，2 ragL)，NAA(03 mgL，06 mg1,，09 mgL)6种处理对栽培匍枝筋骨草幼苗生长和B蜕皮甾酮含量的影响。 结果说明：IBA和NAA对匍枝筋骨草的生长具有促进作用。能够显著提高幼苗总叶绿素含量。 随着IBA和NAA浓度的升高，提高叶绿素含量的程度呈减弱。除NAA 03 mgL和NAA 06 mgL明显降低了可溶性蛋白含量外，其他各处理均能够 提高可溶性蛋白含量，但与对照差异不显著。除NAA 03 mgL对可溶性糖的积累无明显变化外，其他各处理均能显著提高可溶性糖 含量。IBA O5 mgL处理降低了SOD含量，提高了POD含量。NAA09 mgL处理降低了 POD含量，IBA 1 mgL处理提高了POD含量。其他各处理对SOD、POD的影响均与对照 差异不显著，对CAT无明显影响。IBA、NAA处理的B蜕皮甾酮含量均随时间的延长而成上升趋势，处理50d后，各处 理后的含量达最高且均高于对照(B蜕皮甾酮含量为08951 la gg)，IBA 2 mgL处理的B 蜕皮甾酮含量最高为13765 u gg，明显高于其他各处理。 3本实验研究了以白光为对照，采用红色、黄色、蓝色和绿色4种荧光灯处理对匍枝筋骨草 幼苗生长和B蜕皮甾酮含量的影响。结果说明：红、黄、蓝、绿光都对匍枝筋骨草的生长有不同程度的抑制作用。其中，红光的抑制作 用最小，蓝光次之，黄光、绿光的抑制作用最强。不同光质对匍枝筋骨草的生长有显著影响，红光、蓝光能显著提高匍枝筋骨草的叶面 积和地上局部的鲜重，但降低植株的株高和叶绿素的含量。而黄光、绿光那么减少匍枝筋骨草东北林业大学硕士学位论文的叶面积和地上局部的鲜重，而能显著提高匍枝筋骨草的株高和叶绿素的含量。 蓝光可明显提高可溶性蛋白含量，红光处理在45d前可提高可溶性蛋白含量。45d后与对照差异不显著。黄光和绿光明显降低了可溶性蛋白含量。 红光可明显提高可溶性糖含量，黄光与绿光处理会降低可溶性糖含量，蓝光与对照差异不显著。红光、蓝光处理的匍枝筋骨草叶片SoD、POD的活性显著升高，绿光降低了SoD、 CAT、POD含量，黄光降低了POD、CAT含量。红、黄、蓝、白光处理的0蜕皮甾酮含量均随时间的延长呈先上升后下降的趋势，45d 时红光处理的匍枝筋骨草叶片13蜕皮甾酮含量明显高于对照达12987 u egg，黄光、蓝光处 理的略高于对照，绿光那么始终抑制9蜕皮甾酮的积累。长期处理的各种光质均抑制匍枝筋 骨草叶片13蜕皮甾酮的积累。关键词匍枝筋骨草；13一蜕皮甾酮：组织培养；光质；IBA；NAAAbstractAbstractAjuga lobata is a kind of herbaceous perennialResearch showed that the 13-ecdysone call urge the insects to exuviate and metamorphoseIt carl be used as newly nuisanceless pesticideIn order to protect the natural resources，preserve the ecological environment and make Ajuga lobata used sustainably for peoples needs，it has important in practical value to produce secondary metabolites ofAjuga lobata through tissue cultureAjuga lobata was taken as the study object,and studies were carried out as following：1The tissue culture seeding was gotten through culturing Ajuga labata leaves，SO the propagation systern was establishedThe results showed that if use Ajuga labatas young leaves as explants and deal with 3NaCl0 for 10 minutes，the disinfection effect will be betterMS+6-BA lmgL WaSthe optimum multiplication culture mediumMS+6-BA lmgL+2,4-D 04mgL was the optimumcallus culture mediumThe callus WaS good and growing wellMS+瑾IA lmgL Was the optimumculture medium taking rootsThe root system Was thrive and the plant WaS strongThe experimentestablished integral plant regeneration system of Ajuga lobata,and laid the foundation for mass production2Ajuga lobata were cultured under different concentration of IBA and NAA for 50 daysTheexperimental results showed that IBA and NAA Can facilitate the growth of Ajuga lobataIt Call increase the content of the chlorophyllAlong with the growing of concentration with IBA and NAthe extent of mcreasing in chlorophyU WaS reducecL NAA 03 mSL and NAA 06mL reduced the content of the soluble proteinOthers all increaSed the content of the soluble peoteinThere Was no obvious discrepancy conpaned with contrastThere WaS no obvious discrepancy inaccumulation of soluble sugar compared with contrast mA 05mgL reduced the content of SOD，but increased the content ofPODNAA 09mgL redeced the content ofPOD，IBA lmgL increased the content ofPODOthers had no influence on CATThere Was no obvious discrepancy compared with contrastThe content of p-ecdysolle waS increasing under mA and NAAThe content of p ecdysone reached the top and got higher than contrast under all the dispose after 50 daysmA 2mgL was best for the accumulation of 13-ecdysone compared谢廿l contrastThe content Was 13765u gg3Ajuga lobata were cultured under irradiation、il different light spectra for 90 daysThe red light (605um-700nm)，blue light(435nm-480nm)，yellow tight(580nm-595nm)，green light(490 11111- 550 nm)and white light(380 nm一700nm)were usedThe experimental results showed that thereWas different extent ofrestrain iIl Ajuga lobataThe growth of Ajuga lobata under red light，yellowligh：t，green light and blue lightThe extent of restrain under red light WaS leastAnd the blue light took second placeThe yellow light and green light had the strong restrainThe red light and blueIII东北林业大学硕士学位论文tight call increase the leaf area and能Sh weight on the ground but reduce the hight of seeding and chlorophyll content111e yellow light and the green tight call increased the hight of seeding and chlorophyll content but reduced the leaf area and能Sh weight on the groundnle blue tight call increase the content of soluble protein刀把red tight call increase it before 45 days。砀e yellow light and the green tight reduced the content og soluble proteinne red tight Call increase the content of soluble sugar,the yellow tight and green tight can reduce itAnd the blue tight is no different谢1contrast功e red tight and blue nght can increase the content of SOD and POD。the green tight Can reduce the content of SODPOD and CATn玲yellow nght reduced the content of POD and CATnle red tight was best for the plants growth and the accumulation of 13-ecdysone comparedwith the white tightm content was 12987 la眈m accumulation of 13-ecdysone under the bluetight and the yellow tight Was higher than white nghtm green light Was not 900d for the growth ofplants either for the accumulation of 13-ecdysorleLong dealing wnder all kinds of light quality callreduce the accumulation of 13-ecdysoneKeywordsAjuga lobata；p eedysone；tissue culture；tight quality；IBA：NAAIVl绪论1绪论1-1植物组织培养生产植物次生代谢物质的研究进展111植物的次生代谢产物植物次生代谢(secondary metabolism)是相对于初生代谢(primary metabolism)而言 的。初生代谢指包括糖类、脂类、氨基酸和蛋白质以及核苷酸和核酸等合成生物体生存所必 须的化合物。早在1891年Kosse提出了次生代谢这个概念，定义为利用一些有限的初生代谢产物(primary metabolites)经不同的生物代谢途径生成的一系列不同类别中间产物和代谢终 产物的过程【。植物次生代谢产物种类比拟繁多而且结构迥异，包括酚类、黄酮类、香豆 素、木质素、生物碱、糖苷、萜类、多类皂苷、多炔类和有机酸等。因为植物次生代谢产物 具有很多重要的生物学功能，比方提高植物适应环境的能力，提高抵御天敌侵袭能力，增强 抗病能力，提高植物种间的竞争能力，维系植物与其他生物间的互惠关系等【2一】，所以现在 已经普遍应用于医药、化装品、化学药品等各个行业。获取植物次生代谢物质主要有4个途型q一是从天然植物中利用萃取技术进行直接提 取；二是利用细胞工程技术如细胞培养等获得次生代谢物质；三是利用分子生物学手段产生 代谢物质，主要是将代谢过程中的关键酶基因导入到微生物中，并利用微生物发酵来大量产 生次生代谢物质；四是采用化学合成方法进行人工合成。在这4种途径中，植物组织培养和细胞培养等细胞工程技术生产植物次生代谢物质被认为是目前最有希望的一条途径。利用植 物细胞培养生产次生代谢产物有以下4个优点：(1)不会因为地理、气候等条件的影响受到 限制，同样具有合成次生代谢产物的能力：(2)由于结构比拟疏松，容易分散，因此更易于 固相与液相培养，使工业化生产易于实行；(3)可以节省土地面积，降低实验与生产本钱并 且缩短生产周期；(4)在了解次生代谢过程的根底上，可以调控次生代谢过程，比方调控培 养条件、添加代谢前体以及采用诱导子。因此，采用细胞培养来提高药用有效成分以及调控 次生代谢工作是一项很有应用前景的探索性工作，甚至可以认为这是解决各种濒于灭绝的珍 稀名贵药用植物药材资源的主要途径网。自20世纪30年代以来，已经对近1000种植物进 行在细胞培养方面进行了研究，对400多种植物细胞进行在悬浮培养方面进行了研究，并从 中别离获得600多种次生代谢产物，其中大概60多种在含量上超过或接近原有植物，约20 种以上超过干重的l。生产的次生代谢物已超过500种，包括药品、化装品、食品、香 料、色素和杀虫剂等。其中包括比方长春碱，地高辛，东蓑假设碱，山蓑假设碱，小粟碱和奎宁 等等临床上广为应用的药物。很多重要的药用植物比方长春花、人参、紫草、西洋参和黄连 等植物的细胞培养都获得了成功。112植物次生代谢产物的调控提高细胞的生物量和增加产物的积累是提高次生代谢产物的产量所包括的两个方面。然东北林业大学硕士学位论文而，细胞生物量的提高与产物的积累又并不总是十分统一的。很多研究显示，生长迅速并且 未分化的细胞培养物一般不会积累或很少积累次生代谢产物，而次生产物的合成又通常需要 某种程度的形态和生化上的分化。所以，要综合考虑这两方面的因素才能提高次生代谢产物 的产量。影响植物组织和细胞培养过程中植物次生代谢产物产生和积累主要有以下5个因素： (1)生物因素的影响：比方外植体的选择、细胞系的筛选、接种量的多少、细胞分散的程 度、细胞生长的状态、细胞组织分化的程度、毛状根的培养和冠瘤组织的培养、细胞同步化 等；(2)培养基的根本组分的影响：无机盐、碳源、植物生长调节剂等；(3)培养基中附加 物质：如合成目标次生物前体物质、其他有机物、代谢抑制剂、各种诱导子、渗透剂等； (4)培养条件：温度、光、通气、pH、转速、剪切力和渗透压等；(5)培养方式改良：如 固定化培养、二步培养、两相培养、产物转移、微胶囊化培养等。如工业化生产还与培养罐一 类型、通气状况、搅拌等有一定的关系。这些因素都能显著的影响植物细胞中活性成分的含 量，所以，应该综合以上几个因素方面考虑，来刺激植物细胞的产生和增加活性成分。下面 主要从植物生长调节剂和光质两个方面来介绍其对植物次生代谢产物积累的影响。11-2-1植物生长调节剂对植物次生代谢产物的影响 除了营养物质以外，为了促进细胞的生长和次生物质的积累，通常还有必要在培养基中参加一种或几种生长调节剂，这些物质能在低浓度下，对植物生理过程进行调节。添加外源 激素对于植物细胞生长、分化以及次生代谢物的调控具有重要作用。适宜配比和浓度的生长 素和细胞分裂素，能促使细胞保持分裂的状态和一定的分裂频率。添加不同种类和不同浓度的外源激素来对组织培养物的生长和次生代谢进行调控己成为 细胞培养过程的重要手段，主要有细胞分裂素和生长素两大类。生长素和细胞分裂素的种类 与浓度以及二者之间的比例对培养植物的细胞生长和次生代谢产物合成有重要的作用。细胞 培养中常用的生长素有L气A、NAA、2，4-D、BA，细胞分裂素有6-BA、KT、ZT等。已经 证实2，4-D会抑制许多植物细胞培养生产次生代谢物质，比方添加2,4-D后，长春花、毛曼 陀罗、天仙子、颠茄、罂粟等细胞培养物不产生生物碱；在桔叶鸡眼藤悬浮培养物中添加 NAA会促进葸醌的产生，添加2，4_D那么完全抑制蒽醌的合成；而添加NAA在紫草愈伤组织 中那么会抑制紫草宁的生成【6】。细胞分裂素根据代谢类型和相应的植物种类的不同也起着不同 的作用，比方KT能够促进Haplopappus gracilis中花青素的合成而抑制杨属植物中花青素的 合成，高浓度的KT能抑制紫花曼陀罗(Datura mtula)愈伤组织中生物碱的生产，而促进马氏 山莨菪(Scopolia，z甜拥口)培养物中生物碱的生产【71。另外，不同浓度的分裂素和生长素组合 对愈伤组织诱导及继代分化等时期的作用也有很大区别，单独使用2，4-D，KT或KT与IBA 组合都不能诱导银杏幼叶产生愈伤组织或诱导频率很低；而使用NAA与KT或6-BA组合比拟适合诱导幼叶产生愈伤组织81，添加6-BA和2,4-D在继代培养过程中，诱导的愈伤前期生长较快，但继代后易发生褐变【91。其他激素中GA3能够抑制胡萝卜属植物悬浮培养细胞 中黄酮类化合物的合成【101，乙烯能够明显促进欧亚唐松草培养中小檗碱的生成，赤霉素和 脱落酸在很多植物细胞培养中均有抑制作用。1绪论1122光质对植物的生长和次生代谢产物的影响 叶片是植物进行光合作用的主要器官，改变光质会直接影响叶片的生长。在相同光强下，通过不同光质对草莓生长发育的影响发现，与对照相比，绿膜和红膜更有利于草莓植株 叶柄长度和叶面积的增加，而蓝膜处理后的叶柄长度和叶面积明显较低【11】研究显示，蓝光 能够降低植物体内的LA水平而抑制植物的生长；红光对植物子叶的伸长有促进作用，对 茎的过度生长有抑制作用【12】；紫外光会造成植物叶片PS II反响中心失活、光合速率和羧化 效率降低【131。魏胜林在菊花上的研究说明：蓝光对菊花单株总叶面积和总茎长的增加有促 进作用；而红光那么抑制【14】。蓝光处理对叶绿素含量和净光合强度具有促进作用，而红光处 理那么起到抑制作用。光质对次生代谢的影响较为复杂，不同波段光对不同种类的次生代谢物质积累的影响不 同，相同波段的光对同一类次生代谢物质的影响在不同植物的表现不同。简而言之，植物受 光质的影响变化因品种而异；同时，单色光与组合光的影响效应也存在一定程度的差异，不 同光质对植物有效成分积累的影响是不同的，红光对植物体内碳水化合物的积累有促进作 用，而蓝光对蛋白质的含量积累有促进作用【151。赵德修等【161研究了在水母雪莲的组织培养 中，蓝光能够最为有效的促进愈伤组织中黄酮的合成，远红光和白光次之，红光处理后黄酮 含量最低，不同光照组合的结果显示，每天1611蓝光与8h白光组合和8h蓝光加16h白光的 组合，能使够从母莲愈伤组织中获得最高的黄酮含量和黄酮生产率。郑珍贵【l刀等研究显 示，在液体培养基上培养长春花激素自养型细胞系，红光比蓝光更有利于合成长春花阿玛生 物碱。野外和温室的光质处理实验说明，红膜对根的生长抑制程度最小，而对红景天甙含量 的提高最多。关于光质对于芥子油苷含量影响的报道主要集中在红光和蓝光上。测定生长在 有色塑料板反射光下的芜菁中芥子油苷含量，说明在蓝色板下生长的根中芥子油苷含量高， 更辛辣【18】。蓝光可能通过相应受体调控黑芥子酶调节体内芥子油苷代谢【191。另外，在水芹 菜的研究中说明，与正常的光照比照，在红光下，水芹菜中的主要芥子油苷葡萄糖豆瓣素 (ghlc伽astI硎in)含量增多刚，可能是红光调节光敏色素作用的结果。113植物的次生代谢产物与植物源农药到目前为止，防治害虫的主要手段是依靠化学农药，虽然化学农药给人类创造了巨大的 财富，但同时也给环境造成了极大的危害，比方病虫、杂草的抗药性增强，环境遭到污染 等。所以，当前的重要研究方向是要有效地开发低毒、平安、无公害的植物保护剂。植物次 生代谢产物是植物通过次生代谢途径产生的化学物质。植物在长期的协同进化过程当中，通 过次生代谢途径产生植物次生性代谢物质以抵御病虫害的侵入，通过植物次生性代谢产物抑 制其他物种的生长，从而在竞争生长过程中处于相对有利的地位【2l忽】。植物中的次生代谢物 从性质来看，通常分为：苯丙素类、醌类、黄酮类、单宁类、萜类、甾类及其甙类、生物碱 等七大类。其中有很多种次生代谢物质具有杀虫、抑菌或除草的活性。到目前为止，已经查 明的对昆虫起防御作用的次生物质超过3000种，其中多数为黄酮类、萜类和固醇类化学 物。这些物质对昆虫的化学防御主要是忌避作用、抑制取食、抑制生长发育、激素效应、毒东北林业大学硕士学位论文杀作用等田l。植物源农药的开发主要是利用植物体内的次生代谢物质。我国学者对植物源 杀虫剂的研究一般集中在楝科、卫矛科、柏科、豆科、菊科、唇形科、蓼科等植物及其精油 上，对植物中杀虫活性成分的别离鉴定、毒力测定、作用机理和作用方式等均进行了较为系 统的探讨。例如，从黄杜鹃花(Rhododendron molle)中别离的四环二菇化合物对斜纹夜蛾 (Prodenia litura)和甜菜夜蛾(Spodopyera e耐gua)等具有强烈的拒食和毒杀作用瞄】。国外研究 较多的有印楝(Azadirachta indica,AJuss)、番荔枝(Annona squamosa)、万寿菊(Tagetes erectaL)等植物。 一12匍枝筋骨草概述1-2-1匍枝筋骨草的生物学特性及资源分布一匍枝筋骨草(Ajuga lobata)，唇形科，筋骨草属。多年生草本，具匍匐茎，主茎矮，高一一 712cm，直立，通常由中部叶腋抽出1侧枝，枝条伸展，呈匍匐状，节间长约6em，逐节 生根，被淡棕色具节长柔毛或疏柔毛。叶柄长2-4cm，近茎基部者可长达5锄：叶片薄纸 质，圆形或椭圆状圆形，长225em，宽18-24em，先端圆或钝，基部心形或近截形，边缘具不整齐的浅圆齿，具缘毛，两面被疏糙伏毛，下面以脉上为多，下部的叶片通常略带紫 色：苞叶与茎叶同形。花通常单生于茎顶端苞叶腋内；花梗3-4mm。花萼钟形，长约 5mm，基部前方通常稍膨大，具10脉，萼齿5，卵状披针形或宽披每-t-形，长为花萼长的12 或略长，几整齐，仅前方1齿稍短，先端略钝，边缘具缘毛，内面无毛。花冠紫色或红紫 色，筒状，直伸，长1315mm，外面被短柔毛，内面被微柔毛或几无毛，基部前方略膨 大，无毛环，冠檐二唇形，上唇极短，直立，半圆形，顶端微凹，下唇极大，伸长。3裂， 中裂片扇形，中间深裂，侧裂片长圆状披针形，靠近中裂片。雄蕊4，后对略短，均伸出花 冠，花丝挺直，略被疏柔毛或几无毛，花药肾形，贯穿为1室，横裂。花柱露出于花冠，略 超出雄蕊，无毛，上部微弯，先端2浅裂，裂片细尖。花盘环状，前方呈指状膨大。子房4 裂，几无毛或被极疏的微柔毛。小坚果卵状三棱形，长约2mm，反面具明显的网状皱纹， 腹面具1大果脐，几占腹面的45。花期45月，果期57月。产云南西北部，西藏东南部：生于密林下，海拔1500-3000m。尼泊尔，锡金，不丹， 印度东北部，缅甸北部也有。1。22筋骨草属植物的主要化学成分及药理作用筋骨草属植物全株可作为药用，具有清热邪、解热毒、消肿、止痛、解热血、降血压的 成效，可用于治疗呼吸系统、消化系统、肝胆、眼科以及外伤等疾病。比方呼吸道疾病扁桃 体炎、肺炎、咳嗽、伤风感冒等；消化道疾病肠炎、腹泻、痢疾、阑尾炎等；肝胆疾病如肝 炎、黄疸、胆囊炎；眼科疾病如目赤肿痛、结膜炎、胎毒黄染等；外用治疗跌打损伤、骨 折、外伤出血、乳房炎、烫火伤、毒蛇咬伤、疯狗咬伤、痈疽疔疮等124。到目前为止，黄 酮类、甾体类、苷类、二萜类、糖类等化合物已经从筋骨草属植物中别离获得，其中甾酮类 化合物目前主要在该属筋骨草组植物中发现。1绪论甾酮类化合物具有抗肿瘤、利胆、促红细胞生成以及降血脂和降血糖的作用，比方蜕皮 甾酮类化合物杯苋甾酮，对胆汁分泌具有显著的促进作用，能够增加胆汁中的胆酸及胆红素 含量并且降低胆固醇含量瞄】。蜕皮激素对核酸和蛋白质的合成具有促进作用，并能够影响 糖类代谢和脂类代谢，影响中枢神经系统和免疫调节等。日本最早将蜕皮激素在养蚕业上应 用。1969年Nakanishi在蚕的饲料中添加百日清甾酮A，在蚕第4次蜕皮后的第4天添食 051 p头的百日青甾酮A，12h后，100的蚕地吐丝结茧。除此以外，日本还有人利用 保幼激素与B蜕皮激素协同使用，实验显示可以到达增加茧量的作用【261。我国蚕业科学界 随后也开展了这两类激素在桑蚕上的应用研究，将蜕皮激素应用于养蚕业，规模远远超过了 日本。还将蜕皮激素应用于其他养殖业。比方将蚕蛹喂饲小鸡会促进小鸡生长。用蜕皮激素 刺激虾，能够明显促进虾体内蛋白质的合成。如今已经有人将蜕皮激素应用于蟹虾养殖来提 高产量。蜕皮激素还可以用来防治害虫。蜕皮激素能够促进昆虫的蜕皮和变态。高剂量的蜕 皮激素能够扰乱昆虫体内的正常代谢过程，使昆虫提早蜕皮或变态而成为微小成虫或畸形个 体。昆虫对蜕皮激素相当敏感，轻者可以引起昆虫不育，重者可以导致昆虫死亡。国外学者 早就发现了外源蜕皮激素能杀死昆虫，因而提出了将蜕皮激素用作杀虫剂的问题。合成保幼 激素作为第三代农药在国外早已广泛应用，但蜕皮激素由于其来源的限制、未能在农业上用 作杀虫剂推广。苷类成分的苷元有环烯醚萜和二萜类，环烯醚萜苷类化合物8一乙酰基哈巴苷能够抑制 肿瘤细胞生长促进剂诱导产生的病毒早期抗原，有潜在的抗肿瘤活性，可作为抗肿瘤药物使 用【27】。二萜类成分具有抗菌、抗分支杆菌、抗真菌、抗虐、降血糖以及抗癌的作用【28】是该 属植物的主要特征成分；此外二萜类成分对昆虫具有拒食作用，比方Ajugarin I、A jugarin II以及A jugarinm是中等强度的拒食剂【29】。研究说明，筋骨草属植物中，黄酮苷 类具有止咳化痰，解除咽喉肿痛的作用241，其中木犀草素可显著减轻IgA肾病大鼠尿蛋白 的排泄、肾小球中IgA沉积的产生303l】能有效降低蛋白尿、保护肾功能，其降脂作用优于雷 公藤多苷，且无明显肝损害【32】。12-3筋骨草属植物的杀虫作用研究概况筋骨草属植物不仅是优良的中草药资源，也是植物杀虫剂资源。迟德富等人研究发现： 从多花筋骨草、多花筋骨草短穗变种、多花筋骨草莲座变种和线叶筋骨草中提取蜕皮激素类 似物，并稀释成一定浓度，将新鲜枝条在提取液中培养，然后在室内接种桃蚜、柳沫蝉、糖 槭盔蚧等，昆虫通过刺吸取食后，对其生命活动产生了很大影响，多数提取液的25或50倍 液对柳沫蝉的杀虫率都在90以上，但对其寄生性小蜂的羽化率和捕食性天敌异色瓢虫存 活状况影响不大【33】。有研究说明，对舞毒蛾、天幕毛虫和树粉蝶幼虫这几种鳞翅目幼虫采 取浸枝叶饲养的方法，发现多数提取液对这些幼虫的杀虫效果均在90以上，对其生长发 育影响较大刚。从不同时间不同地区多花筋骨草中提取植物源蜕皮激素类似物对杨千橡的2 龄幼虫通过添加饲养的方式进行了测试，发现开花前期采集的多花筋骨草全株比花期和开花 后期采集后的全株提取液更有作用，死亡率达6522。根部提取物死亡率达100，高于茎东北林业大学硕士学位论文部和叶片【巧】。13本研究的目的和意义目前对筋骨草属植物的研究主要集中在提取别离、成分鉴定、活性成分应用，以及医药 应用研究等。对匍枝筋骨草进行组织培养及次生代谢产物的代谢调控的研究尚未见报道。随 着药物需求的急剧增加，生物农药的供不应求，造成了对天然资源的掠夺性开发，使得匍枝 筋骨草资源面临枯竭。应用现代生物技术，利用组织培养的方式来生产匍枝筋骨草次生代谢 产物，既可以满足对匍枝筋骨草的需求，又可以保护自然资源，维护生态环境，不仅不受田 间条件制约，而且用该方法生产植物蜕皮激素次生代谢产物具有生产周期短、效率高、对环 境无污染等特点，因此以植物蜕皮激素类似物为目标产物的细胞或组织培养技术可以为该资 源的有效合理利用奠定良好的根底。植物次生代谢会受到多种生物及非生物因素的影响，只 要我们掌握了各环境因子对其影响规律，就可以通过改善环境条件来提高次生代谢产物含 量。鉴于以上种种因素，本论文开展了生长调节剂和光质对匍枝筋骨草生长及蜕皮甾酮含量 影响的研究，目的在于明确匍枝筋骨草成分与生长调节剂和光质的相关性，从而为人工栽培 匍枝筋骨草如何提高药用成分含量、以缓解野生匍枝筋骨草资源的严重破坏积累根底资料。2材料与方法2材料与方法21匍枝筋骨草组培体系的构建211试验材料购置于2021年4月浙江省杭州蓝天园林种苗公司余姚镇基地，经东北林业大学林学院 植物教研室黄普华教授鉴定为匍枝筋骨草。212方法21-21培养基及培养条件初始培养基：MS+6-BA 1 mgL+NAA 02 mgL：增殖培养基：MS+6-BA(O，05， 1，15，2 mgL)；愈伤培养基：MS+6-BA 1 mgL+2，4_D(O，02，04，06，08，1 mgL)；生根培养基：MS+IBA(O，05，1，2 mgL)NAA(0，03，06，09 mgL)；移栽 基质为蛭石：土=1：1。上述培养基均参加蔗糖20 gL，琼脂56 gL，p14值调至65。培养条 件为培养室内光照培养，温度为25，光暗周期为16 198 h，光照强度2000 lx，湿度为警，70。212-2外植体消毒将叶片用自来水冲洗数次，在超净工作台上用75酒精消毒30 s：无菌水冲去残留酒 精；用3NaCl0溶液对叶片进行消毒，消毒时间分别为5 min，10 min和15 mini无菌水 冲洗35次；将消毒后的叶片切成1 em2大小，然后接种于初始培养基上培养。 2123诱导愈伤组织将初始培养成活转绿的外植体接种到诱导愈伤培养基上，每种培养基接种15瓶，培养 28d，重复3次，观察愈伤组织诱导情况。2124腋芽增殖培养 将诱导出的腋芽接种到增殖培养基中，每种培养基接种20瓶，培养28d，重复3次，观察增殖情况。 2125生根培养选取同代继代培养、生长一致的丛生芽分成单株，接种于生根培养基中。每种培养基接 种15瓶，培养28d后，观察生根状态，统计生根率。2126移栽当根系长至152 gill以上，培养室内将瓶盖翻开，通风炼苗5d，取出小苗洗去根部培 养基，然后移栽到已消过毒的基质中，保持遮阴培养。10d后统计成活率，苗生长情况。东北林业大学硕士学位论文22 IBA、NAA、不同光质处理对栽培匍枝筋骨草生长及蜕皮甾酮含量的 影响2-21试验材料与药品试验材料以移栽苗为材料，栽植于盛有充分混匀的介质花盆中，每盆一株，恢复生长后 开始进行试验。表21试剂与生产厂家Tab2-1 Reagent and their manufacturer药品与试剂生产厂家丙酮西陇化工股份考马斯亮蓝G250上海晶纯试剂牛血清蛋白BSA北京奥博星生物技术有限责任公司蔗糖天津市恒兴化学试剂制造蒽酮乙酸乙酯天津市永大化学试莉 浓硫酸哈尔滨市新春化工产品核黄素天津市科密欧化学试剂石英砂天津石英钟厂霸州市化工分厂三氯乙酸上海市科丰化学试剂磷酸氢二钠天津市恒兴化学试剂制造磷酸二氢钠天津市天河化学试剂厂222方法2221 IBA、NAA处理以喷施清水为对照，设IBA(05，1，2 mgL)，NAA(03，06，09 ragL)ragL)7种处 理，3次重复，每个处理30株，将溶液喷施于植物茎、叶生长部位。每个处理喷施lL，处理 后每7d进行一次取样及各项指标测定，取幼苗叶片做各项生理指标测定，取全株进行蜕皮 激素含量测定，共测定5次，每个处理3个重复。222-2 IBA、NAA处理 不同光质处理以白光(380-700nm)为对照，设红光(605nrn-700nm)、黄光(580nm-595nm)、蓝光(435nm- 480nm)和绿光(490 ll_rfl一550 nm)4种荧光灯进行处理。培养条件为温度30-M，光暗周 期12 h12h，湿度70。取幼苗顶端完全展开的第一片成熟叶片做各项生理指标测定，取 地上局部进行蜕皮激素含量的测定，每15d进行一次取样及各项指标测定，共测定6次，每 个处理5个重复。222-3各项指标的测定 生物量：电子天平精确称量幼苗的鲜重，用直尺和游标卡尺测定株高，叶面积测定仪测2材料与方法定叶面积。叶绿素的测定：参照丙酮提取比色法。取幼苗顶端完全展开的第一片成熟叶片，称重后 放入研钵中，参加2mL纯丙酮研磨成匀浆，倒入5mL离心管中，用80丙酮定容至 4mL，2000rmin离心10min为色素提取液。取色素提取液02mL，参加80丙酮定容至5ml，倒入比色皿中，以80丙酮为对照，用紫外可见分光光度计分别测定663nm、646nm 及470nm处的OD值，测定时重复3次，计算出总叶绿素含量及叶绿素A与叶绿素B的比 值。可溶性蛋白含量的测定：参照考马斯亮蓝比色法。取幼苗顶端完全展开的第一片成熟叶 片，称重后放入研钵中，参加2mL蒸馏水研磨成匀浆，将匀浆倒入到离心管中，然后用 6mL蒸馏水分3次洗涤研钵，全部倒入离心管后，静止051h以充分提取，然后4000 rmin 离心20min，弃掉沉淀，将上清液倒入10mL容量瓶中，用蒸馏水定容后为样品提取液，待 测。取样品提取液10mL放入带塞的试管中，参加5mL考马斯亮蓝G-250溶液，充分混合 后放置2min，倒入比色皿中，用可见分光光度计测定595nm下吸光度，测定时重复3次， 计算并通过标准曲线查得蛋白质含量。可溶性多糖含量的测定：参照葸酮法。取幼苗顶端完全展开的第一片成熟叶片，称重后 剪碎混匀，参加510mL蒸馏水后用塑料薄膜封口，在沸水中加热30min，加热2次，将提 取液过滤，倒入25mL容量瓶中，再用蒸馏水反复漂洗试管和残渣，并定容至25mL得样品 提取液。吸取样品提取液05mL于20mL刻度试管中，参加15mL蒸馏水，05mL葱酮乙 酸乙酯和5mL浓硫酸，充分振荡后立即将试管放入沸水浴中，保温lmin，取出后自然冷却 到室温，以空白为对照，用紫外可见分光光度计测定630nm波长下的吸光度，测定时重复 3次，并计算可溶性糖含量。超化氧歧化酶(SOD)i贝IJ定：参照氮蓝四唑(NBT)法。取幼苗顶端完全展开的第一片成熟 叶片，称重后放入预冷研钵中，参加预冷pH=78磷酸缓冲液2mL，在冰浴下研磨成匀浆， 用磷酸缓冲液冲洗研钵，定容至10mL，在4下10500 rmin离心20min，所得上清液为 SOD粗提液。取4支10mL试管，2支测定，2支对照，分别参加005molL磷酸缓冲液 15mL，130mmolLMet溶液03mL，750pmoVL NBT 03mL，1009molL EDTA-Na2 03mL，1001maolL核黄素03mL，蒸馏水05mL，充分混匀后，在40001x的均匀荧光灯下显色20min，在黑暗下终止反响，在对照管中以磷酸缓冲液代替酶液进行不照光处理为空白对 照，用分光光度计测定560nm处的吸光值， 测定时重复3次，SOD活性单位以抑制NBT 光复原50为一个酶活单位。过氧化氢酶(CAT)测定：参照紫外吸收法。取幼苗顶端完全展开的第一片成熟叶片， 称重后放入研钵中，参加少量石英砂和4下预冷的pH=70的磷酸缓冲液2-3mL，研磨成匀浆，倒入25mL容量瓶中，用磷酸缓冲液冲洗研钵，并定容至25mL。将混合均匀的容量瓶放于5冰箱中静置10min，取出后将上部澄清液4000 rmin离心15min，所得上清液为 过氧化氢酶粗提液，放于5C冰箱保存备用。取4支10mL试管，2支测定，2支对照，分 别参加粗酶液02mL，磷酸缓冲液15mL，蒸馏水10mL，其中对照管参加的酶液为煮沸的东北林业大学硕士学位论文酶液。25预热后，参加01molL1的H202 03mL，开始计时并迅速倒入石英比色皿中，用 紫外分光光度计测定240nm下吸光度，每隔lmin记录一次读数，共测定4rnin，测定时重 复3次，计算出过氧化氢酶的活性。过氧化物酶(PoD)测定：参照愈创木酚法。取幼苗顶端完全展开的第一片成熟叶片，称 重后放入研钵中，参加pH=55磷酸缓冲液适量研磨成匀浆，倒入至5mL离心管中，以 4000 rmin离心10min，将上清液倒入容量瓶中定容至25mL。以加热煮沸5min的酶液为对 照，在01mL酶液中参加005 molL磷酸缓冲溶液29lL；质量分数为2的H20210mE： 005 molL愈创木酚10mL，立即放入37水浴中保温15min，迅速转入冰浴中，并参加质 量分数为20的三氯乙酸20mL终止其反响，过滤后做适当稀释，用分光光度计测定 470nm波长吸光度，测定时重复3次，计算出过氧化物酶的活性。一一一一一23 13蜕皮甾酮的提取及含量测定一231试验材料与药品p蜕皮甾酮标准品(中国药品生物制品检定所)，含量芝99。232仪器设备与试剂jt2-2仪器型号及生产厂家Tab2-2 Apparatus model and their manufacturer233试验方法色谱条件：流动相(甲醇：水=50：50)；柱温：室温；流速：08mLmin：检测波长：242nm。标准溶液：精密称取肛蜕皮甾酮标准品3mg，用甲醇定容于25mL容量瓶中，超声波2材料与方法混匀，得B蜕皮甾酮标准液(012mgmL)。 样品溶液：取新鲜样品于65烘干至恒重后研磨，称取29样品放入50mL锥形瓶中加入20mL 95甲醇浸泡超声30min，10000rmin离心取上清液，再加lOmL 95甲醇于沉淀物中，继续超声15min，10000rmin离心取上清液，合并两次上清参加石油醚进行萃取。待 叶绿素褪去后弃上清，将萃取后的样品用旋转蒸发仪浓缩，4mL色谱甲醇定容。标准曲线的绘制：精密吸取p一蜕皮甾酮标准溶液20、25、50、100、10009L，加甲醇定 容至lmL，每次分别进样20止，重复3次，以峰面积的平均值为纵坐标，质量浓度为横坐 标，得肛蜕皮甾酮回归方程为：y=2E+07x一11681，r2=09999。线性范围：00028pgg- 0141agg。精密度实验：对同一p蜕皮甾酮标准品溶液连续进样5次，每次20此，计算求得峰面积的RSD为1447895。 重现性实验：精密称取5份同一样品粉末，制备供试品溶液进行测定，B蜕皮甾酮浓度RSD为14967。稳定性实验：供试品溶液分别在0、2、4、6、8h测定肛蜕皮甾酮峰面积，计算求得RSD为1488。加样回收率试验：精密称取同一样品5份，每份800耻L，分别参加D蜕皮甾酮标准品 2001,d,，制备成供试品溶液，进行含量测定，计算样品回收率为97，RSD为103。24数据处理所有图、表数据采用Microsoft office 2007 Excel软件进行；方差分析采用DPSv31软件 进行。东北林业大学硕士学位论文3结果与分析31匍枝筋骨草组培体系的构建311外植体消毒时间的筛选叶片在10d后开始分化，在20d后统计分化及污染情况(表31)。随时间的延长，污 染率和成活率随之下降。3NaCl0溶液对叶片消毒5 mill和10 min，分化率较高，但5 rain时污染严重，15 min时污染率低，但叶片出现严重褐化现象，分化率较低。使用3 NaCl0溶液对叶片消毒10 mill最为适宜。一表31灭菌时间与获得无菌体及成活率关系Tab31 The relationship between sterilization time and obtaining aseptic plant and survival rate312 24-0对匍枝筋骨草愈伤诱导及分化的影响愈伤诱导培养7d左右时，外植体边缘出现膨大现象。培养21d时统计情况如下：2,4-D 浓度为02 mgL时，愈伤组织深绿，较硬(图版1)；2争D浓度为04 mgL时，愈伤组织 黄绿，较松散(图版2)：2,4-D浓度为06 mgL时，愈伤组织浅黄，较松散(图版3)：2，4- D浓度为O8 mgL时，愈伤组织浅黄，局部出现褐化现象(图版4)；2，4-D浓度为1 mgL 时，愈伤组织乳白，局部愈伤出现褐化现象(图版5)。培养28d时愈伤组织分化出芽(图版6)。表3-2不同浓度2,4-D对匍枝筋骨草愈伤组织诱导的影响Tab 3-2Effects ofdifferent concentrations of24-D on Ajuga lobata callus induction and growth6-BA浓度24D哆度接种数(们愈伤掣织数诱导率()!坐型曼!翌型垦!i：!：21O24533733304453986670645429333O845378222l45224889313 6-BA对匍枝筋骨草腋芽增值培养的影响1014d时不同浓度6-BA处理的外植体出现不同程度的分化。随着6-BA浓度的升高，3结果与分析植株株高呈先上升后下降的趋势(图3-1)，不定芽增殖个数呈上升趋势(图32)。6BA的 浓度为05 mg：L时，植株较高与对照差异极显著(pO01)，但植株分化出的不定芽较少， 与其它个处理差异极显著(po01)。6-BA的浓度为1 mgL时，株高与对照差异不显著， 但植株分化出的不定芽较多，与对照差异极显著(po01)，且植株茁壮，未出现玻璃化现 象，适宜腋芽增值培养(图版7)。当6-BA的浓度为15 mgL时，植株分化出的不定芽多于其它各处理，差异显著(p005)，但获得的植株矮小。当6-BA的浓度为2 mgL，获得 植株矮小，不定芽过多且玻璃化现象严重(图版8)。l 6l 41 2lO 8O 6之蓦I帽墩颦霹 O 4O 2005l156-BA；浓度IgL图3-1不同浓度6-BA对匍枝筋骨草植株高度的影响F