生物技术制药大题

文档供参考，可复制、编制，期待您的好评与关注！ 现代生物药物分类：重组DNA技术制造的多肽、蛋白质类治疗剂基因药物：基因治疗剂、基因疫苗和反义药物等。天然生物药物：来自动物、植物、微生物和海洋生物的天然产物。合成与部分合成生物药物。生物技术药物的特性:分子结构复杂；具有种属特异性；治疗针对性强、疗效高；稳定性差；基因稳定性；免疫原性；体内的半衰期短；受体效应；多效性和网络效应；检验的特殊性重组蛋白质分离纯化的方法及目的：1、离心/过滤（去除细胞、细胞碎片、颗粒性杂质） 2、阴离子交换层析（去除杂质蛋白、脂质、DNA和病毒等） 3、40nm微孔滤膜过滤（进一步去除病毒） 4、阳离子交换层析（去除牛血清蛋白或转铁蛋白等） 5、超滤（去除沉淀物及病毒） 6、疏水层析（去除残余的杂蛋白） 7、凝胶过滤（与多聚体分离） 8、0.22um微孔滤膜过滤（除菌）宿主细胞的分类：1原核细胞：常用的有大肠杆菌（分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包涵体，不存在翻译后修饰作用，对蛋白质产物不能糖基化。）、枯草芽孢杆菌（分泌能力强，不形成包涵体，不能使蛋白质糖基化。）、链霉菌（重要的工业微生物。分泌能力强，具有糖基化能力。）等；2真核细胞：酵母（表达产物直接分泌到细胞外，分泌能力强，表达产物能糖基化。）、丝状真菌（很强的蛋白质分泌能力，能正确进行翻译后加工，包括肽剪切和糖基化。）、哺乳动物细胞（表达产物可由重组转化的细胞分泌到培养液中，产物是糖基化的，接近或类似于天然产物。）。影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素：（1）外源基因的计量（2）外源基因的表达效率：启动子的强弱、核糖体结合位点的有效性、SD序列和起始密码的间距、密码子组成（3）表达产物的稳定性（4）细胞的代谢负荷（5）工程菌的培养条件真核基因在大肠杆菌中的表达的形式：以融合蛋白的形式表达药物基因、以非融合蛋白的形式表达药物基因、分泌型表达蛋白药物基因影响目的基因在酵母中表达的因素：外源基因的剂量、外源基因的表达效率（启动子、分泌信号、终止子）、外源蛋白的糖基化、宿主菌株的影响基因工程药物生产的过程：获得目的基因、组建重组质粒、构建基因工程菌、产物分离纯化、除菌过滤、半成品检定、成品检定、包装。提高质粒稳定性的方法：选择合适的宿主菌、选择合适的载体、选择压力、分阶段控制培养、控制培养条件、固定化基因工程菌的培养方式：1. 分批培养2. 补料分批培养：将种子接入发酵反应器中进行培养，经过一段时间后，间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的方法。3. 连续培养：将种子接入发酵反应器中，搅拌培养至一定菌体浓度后，开动进料和出料的蠕动泵，以控制一定稀释率进行不间断的培养。4. 透析培养利用膜的半透性原理使代谢产物和培养基分离，通过去除培养液中的代谢产物来解除其对生产菌的不利影响。5. 固定化培养：将固定化技术用于工程菌的培养，质粒稳定性大大提高，特别是对分泌型菌种有利基因工程菌的不稳定性有哪几种？如何对它进行改善1分裂不稳定：指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。2结构不稳定：指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变改善1、选择合适的宿主菌2、选择合适的载体3、选择压力4、分阶段控制培养5、控制培养条件6、固定化基因工程药物的分离纯化：细胞破碎、固液分离、浓缩与初步纯化、高度纯化直至得到纯品、成品加工。分离纯化的方法一、根据分子大小不同的纯化方法1.透析和超滤2.密度梯度离心 3.凝胶过滤二、根据电荷不同的纯化方法1.电泳2.聚丙烯酰胺凝胶电泳3.毛细管电泳4.等电聚焦5.层析聚焦6.离子交换层析 三、利用选择性吸附的纯化方法：疏水作用层析 四、利用配体的特异性亲和力的纯化方法：亲和层析包含体表达形式的优点：高密度，易于分离纯化，能简化外源基因表达产物的分离操作；有效地抵御了大肠杆菌中蛋白酶对目的蛋白的降解，在一定程度上保持表达产物的结构稳定；对宿主细胞无毒害。包含体表达形式的缺点：丧失了原有的生物活性，必须通过有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构象的目标蛋白；体外复性蛋白质成功率低，不超过30%。动物细胞的生理特点：1、细胞的分裂周期长 2、细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象 3、正常二倍体细胞的生长寿命是有限的 4、动物细胞对周围环境十分敏感 5、动物细胞对培养基的要求高 6、动物细胞对蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同动物细胞制药的前景与展望：1、改进表达载体，提高表达水平和产量 2、利用代谢工程，改进培养工艺，降低生产资本 3、抑制细胞凋亡，延长培养周期 4、采用糖基化工程，提高产品质量 5、转基因动物的研究 6、组织工程的研究HAT培养基的原理:它是用次黄嘌呤（H）、氨基碟呤（A）和胸腺嘧啶（T）配制的。其中氨基碟呤能阻断DNA合成的主要途径，瘤-瘤融合细胞和瘤细胞不能合成DNA而死亡。脾-脾融合细胞和瘤细胞在这样的组织培养条件，几天内亦迅速死亡。由于SP2/0等骨髓细胞都是次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）缺乏株，脾细胞内却有这种酶，因此脾-瘤融合的杂交细胞可利用HGPRT，用次黄嘌呤(H)和胸腺嘧啶（T）合成DNA，使杂交瘤细胞得以生长。制备双功能抗体的方法：1、非共价键二聚体 2、共价连接双特异单链抗体 3、应用亮氨酸拉链、螺旋-转角-螺旋灯蛋白质结构域将两单链抗体连接起来抗体融合蛋白的类型：1、配基-配基型融合蛋白 2、配基-Ig型嵌合蛋白 3、配基-Fv型嵌合蛋白 4、受体-Fv型融合蛋白 5、酶-抗体型融合蛋白构建抗体融合蛋白的基本原则：将第一个蛋白的终止密码子删除，再接上带有终止密码子的第二个蛋白基因，即可实现两个基因共表达。在构建过程中关键的问题是两个蛋白间的街头序列连接肽，一般来说35个氨基酸就可满足大部分融合蛋白的正确折叠的要求，加入一段有疏水性和一定伸展性的较长肽链，可缓解两种蛋白相互干扰。噬菌体抗体库技术的基本方法：获取目的基因，抗体库技术的载体，淘筛，表达和检定噬菌体抗体库技术的特点：1、将抗体的基因型与表达型紧密联系 2、模拟天然全套抗体库 3、避开了人工免疫和杂交瘤技术 4、可获得高亲和力的人源化抗体植物培养细胞的生理特性：1、植物细胞较大，有纤维素细胞壁，细胞耐拉不耐扭，抗剪切力差 2、生长速度缓慢，易被污染，需用抗生素 3、细胞生长的中期及对数期，多以非均相集合体的细胞团形式存在，悬浮培养较难 4、培养时需供氧，培养液粘度大，不能耐受强力通风和搅拌 5、具有群体效应，无接触抑制性 6、产物多停留于细胞内，且产量较低 7、细胞重量的增加在对数期，次级代谢产物的累积在稳定期影响植物次级代谢产物累积的因素：1、生物条件（外植体、季节、休眠、分化）2、物理条件（光、温度、PH、通气）3、化学条件（培养基的化学组成、渗出物）4、工业培养条件（两步培养法、搅拌频率、培养容器的影响）植物细胞大规模培养需考察的因素：1、供氧能力及气泡分散程度 2、剪切力大小及对细胞的影响 3、高密度培养时培养液的混合程度 4、温度、PH及营养物浓度的控制能力 5、细胞团大小的控制能力 6、易于放大利用微生物生产酶制剂的优点：（1）能够生产酶的微生物种类繁多，有较大的选择余地。（2）微生物繁殖快、培养周期短、培养方法简便，培养过程容易控制，（3）微生物具有较强的适应性，能够培育出新的高产菌株。固定化细胞的特点：1、无需进行酶的分离纯化 2、细胞保持酶的原始状态，固定化过程中酶的回收率高 3、细胞内酶比固定化酶稳定性高 4、细胞内酶的辅助因子可以自动再生 5、细胞本身含多酶体系，可催化一系列反应 6、抗污染能力强固定化酶的性质：（1）酶活力的变化 （2）酶反应特性的变化 （3）最适PH值 （4）最适温度 （5）米氏常数 （6）最大反应速度固定化酶的特点：（1）固定化酶属于修饰酶，这种酶可以通过化学、生物、分子工程手段加以改良。（2）固定化酶的稳定性很高，可以多次连续使用。（3）反应以后，产物中不含酶，易于纯化。（4）反应条件易于控制，可实现连续化和自动控制。（5）酶的利用率高，酶的实际使用量较少。（6）固定化酶比水溶性酶更适合进行多酶反应。固定化反应器的类型：（1）间歇式搅拌反应罐（BSTR）（2）连续流动搅拌反应罐（CSTR）（3）填充式反应罐（PBR）（4）流化床反应器（FBR）（5）循环反应器（RCR）（6）连续流动搅拌超滤膜反应器（CSTR/UF）（7）其它反应器反应器的选择依据：（1）根据固定化酶的形状来选择。（2）根据底物的物理性质来选择。（3）根据外界环境条件对于酶的稳定性来选择。（4）根据操作要求和固定化酶反应器的投资费用来选择。酶化学修饰的方法1.酶的表面化学修饰(大分子修饰、小分子修饰、交联修饰、固定化修饰)2、酶分子内部的修饰（非催化活性基团的修饰、蛋白主链修饰、催化活性基团的修饰、与辅因子相关的修饰、肽链伸展后的修饰）3.结合位点突变的化学修饰有机相酶反应的优点：1、增加疏水性底物或产物的溶解度 2、热力学平衡向合成方向移动 3、可抑制有水参与的副反应 4、酶不溶于有机介质，易于回收再利用 5、易从低沸点溶剂中分离纯化产物 6、酶的热稳定性提高，pH的适应性扩大 7、无微生物污染 8、能测定某些在水介质中不能测定的常数 9、固定化酶方法简单修饰酶的特性：1、热稳定性提高2、抗各类失活因子能力提高3、抗原性消失4、体内半衰期延长5、最适pH改变6、酶学性质变化7、对组织分布能力改变有机相酶反应的溶剂体系：水水溶性溶剂均相体系、水水不溶性溶剂两相体系、胶束与反相胶束体系、单相有机溶剂体系有机相酶反应的优点：1、增加疏水性底物或产物的溶解度 2、热力学平衡向合成方向移动 3、可抑制有水参与的副反应 4、酶不溶于有机介质，易于回收再利用 5、易从低沸点溶剂中分离纯化产物 6、酶的热稳定性提高，pH的适应性扩大 7、无微生物污染 8、能测定某些在水介质中不能测定的常数 9、固定化酶方法简单抗生素生物合成基因的结构特点：1、高G-C碱基组成 2、属于同一个基因簇 3、抗生素生物合成基因除在染色体上外，有的也定位在质粒上克隆抗生素生物合成基因的方法：1、在准宿主系统中克隆检测单基因产物 2、阻断变株法 3、突变克隆法 4、直接克隆法5、克隆抗生素抗性基因法 6、寡核苷酸探针法 7、同源基因杂交法基因工程抗体概念及其目的: 基因工程抗体：又称重组抗体，是指利用重组DNA和蛋白质工程技术对编码抗体的基因按不同需要进行加工改造和重新装配，经转染适当的受体细胞所表达的抗体分子。目的：降低鼠源性单克隆抗体分子的免疫原性、降低抗体的相对分子质量，以增加组织的透过性基因工程抗体改造实例：免疫原性：人一鼠嵌合抗体 改型抗体 分子量：Fab、Fv、ScFv、单域抗体基因表达研究关注的主要问题:1目的基因的表达产量2表达产物的稳定性3产物的生物学活性4表达产物的分离纯化。影响植物次生代谢积累因素一、生物条件。外植体：培养时期、大小、前处理、细胞密度 。季节 休眠 分化二、物理条件 光：植物光照和激素具有协同作用或对抗作用 温度 ph 通气三、化学条件 培养基的化学组成 渗出物 四、工业培养条件 两步培养法细胞工程：按照一定的设计方案，通过在细胞、亚细胞或组织水平上进行实验操作，获得重构的细胞、组织、器官以及个体，创造优良品种和产品的综合性生物工程。包括的技术：真核细胞的基因重组、导入、扩增和表达的理论和技术；细胞融合的理论和技术；细胞器特别是细胞核移植的理论和技术；染色体改造的理论和技术；转基因动植物的理论和技术；细胞大量培养的理论和技术，以及将有关产物提取纯化的理论和技术 ；论述：基因工程药物生产的过程（论述）：基因工程技术就是将所要组建对象的目的基因插入载体、拼接、转入新的宿主细胞，构建成工程菌，实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术。基因工程药物制造的主要步骤是：目的基因的克隆，构建DNA重组体，构建工程菌，目的基因的表达，外源基因表达产物的分离纯化，产品的检验等。可分为上游和下游两个阶段。上游阶段：主要是分离目的基因、构建工程菌(细胞)。目的基因获得后，最主要的就是目的基因的表达。选择基因表达系统主要考虑的是保证表达的蛋白质的功能，其次是表达的量和分离纯化的难易。此阶段的工作主要在实验室内完成。下游阶段：从工程菌的大量培养一直到产品的分离纯化和质量控制。此阶段是将实验室的成果产业化、商品化，主要包括：工程菌大规模发酵最佳参数的确立、新型生物反应器的研制、高效分离介质及装置的开发、分离纯化的优化控制、高纯度产品的制备技术、生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造、电子计算机的优化控制等。动物细胞的培养条件，培养方法与培养方式：培养条件（1）器材的清洗和消毒：器材的清洗：浸泡、刷洗、泡酸、冲洗；器材的消毒灭菌：物理消毒、化学消毒（2）水质：电阻值大于18M,去热原。（3）pH：7.27.4（4） 渗透压：290300mOsm/kg（5） 温度：370.5 C（6） 空气：氧的饱和质60%，氧分压40.7kPa培养方法：【1】细胞分离（1）离心分离法。主要用于从含有细胞的体液如血液，羊水，胸腹水中分离细胞，离心速度过高或时间过长，易挤压细胞使之受损伤或死亡。（2）消化分离法。是从生物体取来组织块，将其剪碎，并用消化液将其消化，使组织松散或细胞悬液然后用缓冲液洗涤，离心，去除残留的消化液而获得所需的细胞。【2】细胞计数（1）自动细胞计数器计数。原理：让一定体积的细胞悬液经一小孔，并在两个电极间通过，此时通过的细胞就会对电极产生干扰而使电压发生改变，这样就会在电子计数器上形成一个信号被记录下来（2）血球计数板计数（3）结晶紫染色细胞核计数法（4）MTT染色计数法。该方法的原理是活细胞内的线粒体脱氢酶能将MTT(淡黄色)转变为不可溶性的紫色甲 结晶，它可溶于脱色液，其色泽的深浅与活细胞的数量成正比，通过比色即可从标准曲线求出细胞数。【3】细胞传代。（1）悬浮细胞的传代（2）贴壁细胞的传代【4】细胞冻存和复苏。（1）细胞的冻存。在冻存时，冷冻速度很重要，不能太快也不能太慢（2）细胞的复苏。复苏时总的要求是快融mtt原理：活细胞中线粒体脱氢酶能将四唑盐（淡黄色）还原成不溶干水的紫色产物甲臢（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值动物细胞大规模培养的方法【1】悬浮培养。让细胞自由地悬浮于培养基内生长增殖【2】贴壁培养。必须让细胞贴附在某种基质上生长繁殖的培养方法【3】贴壁-悬浮培养。（1）微载体培养（2）包埋和微囊培养（3）结团培养操作方式【1】分批式操作【2】半连续式操作【3】灌流式操作大肠杆菌表达系统中表达载体必须具备的条件：（1）载体能够独立的复制；（2）具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记，以篮球外源基因的克隆、鉴定和筛选；（3）具有很强的启动子，能为大肠杆菌的RNA聚合酶所识别；（4）具有阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录；（5）具有很强的终止子，以便使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因， 而不转录无关的基因；（6）所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号，即起始密码AUG和SD序列， 以便转录后能顺利翻译。基因工程生长代谢菌的特点？菌体的生长通常用比生长速率来表示。控制菌体的生长对提高质粒的稳定性、减少代谢副产物积累、提高外源蛋白产率有重要意义。 工程菌培养可通过选用不同的碳源控制补料和稀释速率等方法来控制菌体的生长。大肠杆菌的蛋白/菌体量的比值是基本恒定的，因而菌体的生长速度反映了蛋白质的合成速度。培养条件的改变，都会改变菌体的能量代谢和小分子前体的供应，影响生物大分子的合成和菌体的生长。对菌体生长的调控主要有两种观点：一种观点认为能量的供应决定了菌体的最大比生长速率；另一种观点认为是小分子前体和催化组分的限制决定了菌体的最大比生长率。一、菌体的生长与能量的关系1、碳源物质是组成培养基的主要成分。碳源物质为细胞提供能量；当菌体生长所需能量大于菌体有氧代谢提供的能量时，菌体会产生代谢副产物乙酸；高浓度的乙酸明显抑制菌体的生长。乙醇的抑制作用与pH有关，适当提高pH，可减少乙酸的抑制作用。培养方式中的措施：分批培养中选择不同的碳源，补料培养中通过控制补料速度，连续培养中控制稀释速度等培养方法，都能一定范围内控制菌体的生长，从而控制乙酸的产生，减少它的抑制作用，以实现工程菌的高密度培养和提高重组产物的表达水平。加入蛋氨酸和酵母提取物都能减少乙酸的产生。实质：控制菌体的糖酵解速度，使之低于三羧酸循环和呼吸链的最大代谢能力，从而避免乙酰辅酶A的积累和乙酸的产生。代价：降低供能速度或前体供应速度来降低蛋白合成和菌体生长速度2、 菌体生长与前体供应的关系：在基础培养基中加入氨基酸（小分子前体）能使菌体比生长率提高，蛋白合成增加。由于菌体中小分子前体量和催化结构是有限的，因而生物大分子的合成处于亚饱和状态，限制了菌体的比生长速率。基因表达在各个水平的竞争又是各个基因互相竞争共同的前体和催化结构的结果。对于基因工程菌来说，由于基因工程菌质粒的复制和外源基因的转录和翻译需要与宿主细胞竞争共同的前体和催化结构，从而加剧了这些成分的不足，因而在同样的培养基中，工程菌的比生长速率往往低于其宿主细胞，特别是工程菌诱导后，由于外源基因的大量表达，引起菌体比生长速率下降，甚至生长停滞。质粒存在对菌体代谢的影响：中等拷贝质粒（56拷贝）的工程菌中与前体合成有关的酶增加，这些酶的基因大多受终产物的反馈调节。高拷贝质粒的工程菌（240拷贝）中，生长速率和菌体总蛋白合成均减少。这与工程菌大量前体被利用引起前体不足，从而产生“严紧反应”有关。“严紧反应”是当氨酰tRNA不足时,核糖体在密码子上停留,并合成被称为魔点的ppGpp的结果。ppGpp是一个重要的调控分子。两种观点：ppGpp的浓度增加会导致在合成mRNA和rRNA时RNA聚合酶在模板上的移动产生停顿，RNA链延长速度减慢，使游离的RNA聚合酶浓度降低，严紧控制的启动子如rrnA等的转录减少；也可能ppGpp是通过干扰RNA聚合酶与PL启动子专一识别反应。固定化酶的优点及如何制备？固定化酶的优点：（1）固定化酶属于修饰酶，这种酶可以通过化学、生物、分子工程手段加以改良。（2）固定化酶的稳定性很高，可以多次连续使用。（3）反应以后，产物中不含酶，易于纯化。（4）反应条件易于控制，可实现连续化和自动控制。（5）酶的利用率高，酶的实际使用量较少。（6）固定化酶比水溶性酶更适合进行多酶反应。酶的固定化，就是通过载体等将酶限制或固定于特定的空间位置，使酶变成不易随水流失即运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂。根据酶的应用目的和特性来选择固定化方法。酶固定化的方法：1载体结合法（物理吸附法、离子结合法、共价结合法）载体结合法是将酶结合到不溶性载体上的一种固定化方法，根据结合形式的不同，可以分为物理吸附法、离子结合法和共价结合法等三种；2交联法：用双功能或多功能试剂使酶与酶或微生物的细胞与细胞之间交联的固定化方法；3包埋法（网格型、微囊型）将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法。包埋法可分为网格型和微囊型两种。将酶或细胞包埋在高分子凝胶细微网络中的称为网格型，将酶或细胞包埋在高分子半透膜中的称为微囊型；4热处理（细胞）。 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