提取酵母细胞壁中葡聚糖的新方法

文档供参考，可复制、编制，期待您的好评与关注！ 提取酵母细胞壁中B-D-葡聚糖的新方法摘 要 研究了一种从酵母细胞壁中提取B-D-葡聚糖的新方法,包括高温抽提、脱脂和酶解3部分。在高温条件下分别考察了pH、料液比、温度及时间对B-D-葡聚糖得率和纯度的影响。结果表明,高温提取的最佳工艺条件为:料液比为1B15、pH=8、温度120e,时间3 h,B-D-葡聚糖得率为61105%,纯度达到41151%;为了进一步提高B-D-葡聚糖的纯度,采用了脱脂和酶解的方法去除粗多糖中的蛋白质、脂质等杂质,最终产品的纯度达到78131%。关键词 B-D-葡聚糖,酵母细胞壁,提取 B-D-葡聚糖是一种极富生物活性的多糖,具有较强的免疫及抗肿瘤活性。在酵母细胞壁中含有大量的B-D-葡聚糖。目前该资源主要是作为饲料廉价销售,造成资源浪费,利用现代科技手段从酵母细胞壁中提取B-D-葡聚糖是实现其综合利用的有效措施。传统的提取方法有酸法、碱法、酸碱结合方法,但提取条件都较为剧烈,且酸碱试剂易腐蚀设备,环境污染严重,尤其是在提取过程中部分B-D-葡聚糖会降解,造成产品得率与生物活性的降低。本文采用了一种较为温和的提取B-D-葡聚糖方法,包括高温抽提、脱脂和酶解3部分,操作过程简便、快速,易于大规模生产,更为重要的是避免了酸碱条件对产品带来的降解作用,同时副产物甘露聚糖是动物营养与免疫研究和应用中的主要功能性多糖,因而具有一举两得的效果。1 材料与方法111 仪器Waters 600高效液相色谱仪(配置Waters 600四元输液泵, 2410示差折光检测器, 7725 i进样阀,Empower色谱工作站);高压灭菌锅(上海第一医疗器械厂);QT-1漩涡混合器(上海琪特分析仪器有限公司);德国ChristALPHA 1-4LSC冷冻干燥机(北京鑫盛鸿阳科技有限公司);Avanti J-26XP系列高效离心机(贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司)。112 试剂酵母细胞壁(安琪酵母有限公司提供),蛋白酶Protamex、Savinase、Neutrase、Alcalase 214L(丹麦No-vozymes公司提供),Protex40L(Genencor公司提供),胰蛋白酶和CP酶(复合蛋白酶)(无锡杰仁生物科技公司提供),所有化学试剂均为分析纯。113 B-D-葡聚糖的提取高温提取:用缓冲液配成一定质量浓度的酵母细胞壁悬浮液于250 mL三角瓶中(加入直径015cm玻璃珠),分别在不同pH、时间、温度、料液比下进行高温抽提,离心,沉淀用水洗涤3次,冷冻干燥,得到水不溶性粗多糖,备用。脱脂:取得到的水不溶性粗多糖,按照1B20(gBmL)的比例分别与不同的有机溶剂配成悬浮液,不同有机溶剂为:V(正己烷)BV(甲醇)=4B1、异丙醇、石油醚、无水乙醇、正己烷等,加热回流5 h,进行脱脂处理,反应结束后得到脱脂粗多糖, 40e真空干燥,备用。酶解:脱脂得到的粗多糖经酶解脱去残余蛋白质,采用的蛋白酶有:中性蛋白酶Neutrase、碱性蛋白酶Savinase,Alcalase 214T及Protex 40L、复合蛋白酶Protamex、胰蛋白酶和CP酶等,反应结束后,得到的残渣用水洗涤3次,离心,再加水复溶后于100e加热5 min灭酶,离心,真空干燥,得到淡黄色粉末即为B-D-葡聚糖产品。114 B-D-葡聚糖含量的测定H2SO4水解:准确称取100 mg左右酵母细胞壁粉末(B-D-葡聚糖产品或其中间产物粗多糖)于25mL具塞试管中,加入115mL 72% H2SO4,漩涡混匀,室温静置3 h,然后加入一定浓度阿拉伯糖溶液作为内标物,再加入去离子水使H2SO4的最终浓度为1食品与发酵工业FOOD AND FERMENTATION INDUSTRIES190 2011 Vol137 No11 (Total277)mol/L,充氮气,真空封管, 100e水解5 h,取出冷却至室温,用Ba(OH)2中和,离心,得上清液A,用水洗涤3次,合并A和所得洗涤液,最后定容至100 mL,过滤后用HPLC进样检测。色谱条件:色谱柱: Sugar-Pak 1 615 mm i1d1300 mm;流动相:超纯水;流速: 014 mL/min;柱温:85e;检测:示差折光检测器。B-D-葡聚糖含量的计算:称取一定量的内标物,加入到葡萄糖中组成标准品溶液,然后将相同量的内标物加入到同体积的样品溶液中组成样品溶液,将2种溶液分别进样,根据下述公式计算得到样品中葡萄糖的含量再乘以葡聚糖的转换系数019,得到样品中葡聚糖的含量。(Ai/As)样品(Ai/As)标准=(Ci% )样品(Ci% )标准式中, i为葡萄糖, s为阿拉伯糖。115 总蛋白含量的测定采用凯氏定氮方法。116 脂质含量的测定准确称取5 g左右干燥样品,按照1B20(gBmL)的比例与V(正己烷)BV(甲醇)=4B1配成悬浮液,加热回流5 h,然后将所得抽提物冷却至40e,蒸发得A1;经抽提后所得残留物依次经正己烷、甲醇、丙酮溶液洗涤,合并A1和所得洗涤液,旋转蒸干至恒重,准确称重并计算脂质含量。117 分子质量分布分析高效体积排阻色谱法(HPSEC)。仪器:Waters 600高效液相色谱仪(配2410示差折光检测器和M32工作站)。色谱条件:色谱柱:UltrahydrogelTMLinear300 mm718 mm id2;流动相: 011 mol/L NaNO3;流速:019 mL/min;柱温: 45e;进样体积: 10LL。样品制备:样品用二甲亚砜溶解、配制成35mg/mL溶液, 50e超声处理23 min。相对分子量校正曲线所用标准品: Dextran T-2000 (MW2000 000), DextranT-580(MW580 000),Dextran T-190 (Mw188 000 ), Dextran T-70 (MW70 000),DextranT-10 (MW10 000),DextranT-5 (MW4 600),Maltopentaose (MW828)。2 结果与讨论211 料液比对粗多糖纯度和得率的影响在反应温度120e,时间4h, pH810(011 mol/L磷酸盐缓冲溶液配制)的条件下,考察料液比对粗多糖纯度和得率的影响,结果如图1。粗多糖的纯度随着缓冲液比例的增加而升高,得率随着缓冲液比例的增加而下降,这是由于缓冲液比例的增加使得酵母细胞壁粉末与缓冲溶液之间的抽提作用更加充分,甘露聚糖蛋白溶出增多,所以粗多糖纯度升高,随之得率下降。图1 料液比对粗多糖纯度和得率的影响212 pH值对粗多糖纯度和得率的影响准确称取5 g左右酵母细胞壁粉末,按照1B10(gBmL)料液比,温度120e,时间4 h, pH值分别为510、610(用011 mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配制)、710、715、810(用011 mol/L磷酸盐缓冲液配制); 815、910、915、10(011 mol/L硼酸氯化钾-氢氧化钠缓冲液配制)的条件下,考察pH值对粗多糖纯度和得率的影响。图2 pH值对粗多糖得率和纯度的影响如图2所示,在弱酸性至碱性范围内,粗多糖纯度的变化主要在pH值715815有明显下降的趋势,随着pH值进一步增大,纯度逐渐升高;得率出现先下降再上升再下降的变化趋势。因为酵母细胞壁中含有的甘露聚糖蛋白不易溶于弱酸性环境,但能以整体形式溶于碱性条件,所以随着pH值从弱酸性变化到中性(57),甘露聚糖蛋白的溶解性逐渐增大,得率逐渐下降;随着pH值的进一步增大,得率反而上升,这可能是因为酵母细胞壁中含有的蛋白质在等分离与提取2011年第37卷第1期(总第277期)191 电点时溶解度降低,易沉淀析出,导致粗多糖得率上升的原因;在pH值81510,甘露聚糖蛋白能以整体溶于碱性条件,所以得率会下降。综合考虑到粗多糖纯度、得率以及过碱会造成粗多糖降解等影响因素,最终选择pH7158的范围优化提取的最佳组合。213 温度对粗多糖得率和纯度的影响按照料液比1B10(gBmL), pH值8(011 mol/L磷酸盐缓冲液配制),反应4 h条件下,考察温度对粗多糖得率和纯度的影响。如图3所示,随着温度的升高粗多糖得率在100110e下降明显,随后温度升高得率变化趋于平缓;纯度随着温度的升高而增大,考虑到高温有可能导致多糖结构降解,故选择反应温度为115125e。图3 温度对粗多糖得率和纯度的影响214 时间对粗多糖得率和纯度的影响按照料液比1B10(gBmL), pH8(011 mol/L磷酸盐缓冲液配制),温度120e的反应条件下,考察时间对粗多糖得率和纯度的影响,结果如图4所示。图4 时间对粗多糖得率和纯度的影响随着时间的延长纯度呈现上升的趋势, 4 h后纯度变化趋于稳定;得率随时间延长呈现出下降的趋势,在3h后值趋于稳定。随着抽提时间的延长,甘露聚糖蛋白溶出值基本不变,考虑到高温可能使粗多糖造成一定的降解,因此时间并非越长越好,选择在35 h即可。215 正交试验考察粗多糖得率和纯度的影响在单因素试验考察的基础上,选择在pH值为810的条件下,从温度、时间、料液比3个影响因素设计正交实验,考察其对得率和纯度的影响。表1 正交试验因素水平表水平因素温度/e提取时间/h料液比(gBmL)1 115 3 1B102 120 4 1B153 125 5 1B20表2 正交试验结果试验号温度/e时间/h料液比(gBmL)纯度/%得率/%1 115 3 1B10 34108 701482 115 4 1B15 35121 621183 115 5 1B20 38141 60164 120 3 1B15 41151 611055 120 4 1B20 38152 591686 120 5 1B10 33192 641337 125 3 1B20 36139 561698 125 4 1B10 37153 631499 125 5 1B15 26 60156k13519 37132 35117k237198 37108 34124k33313 32178 37177R4168 4154 3153 比较表2中的几个因素的极差R可以看出,影响酵母粗多糖纯度的各因素的顺序为:温度时间料液比,且在pH值8、时间3 h、温度120e、料液比为1B15的条件下纯度最高为41151%,虽然此条件下得率不是最高,但是考虑首要目的是要提高纯度,所以选择最佳抽提组合为时间3 h、温度120e、料液比为1B15。216 有机溶剂处理采用不同的有机溶剂对高温抽提得到的酵母粗多糖进行脱脂处理,如图5,实验结果表明实验室仅作分析用V(正己烷):V(甲醇)=4B1的脱脂效果最好,如果工业化生产考虑到甲醇的安全性问题,可以用无水乙醇代替。A-V(正己烷)BV(甲醇)=4B1;B-V(正己烷)BV(乙醇)=4B1;C-正己烷; D-无水乙醇; E-石油醚; F-异丙醇图5 不同有机溶剂对脂质去除的影响食品与发酵工业FOOD AND FERMENTATION INDUSTRIES192 2011 Vol137 No11 (Total277)另外,经高温抽提得到的细胞壁中还含有蛋白质,脂质的存在可能会影响蛋白酶的作用效果,因此考察比较了脱脂与蛋白酶处理的先后顺序的影响,选择了碱性蛋白酶Savinase,实验结果证明先脱脂后蛋白酶处理测得总蛋白含量为4194%,蛋白酶处理后脱脂测得为5150%,所以,采用先脱脂后蛋白酶处理的工艺。217 蛋白酶处理经过以上各步的处理,得到的粗多糖中仍含有残余的甘露聚糖蛋白,甘露聚糖通过蛋白质中的丝氨酸和苏氨酸与B-D-葡聚糖以共价键相连接,因此可以选用合适的蛋白酶水解蛋白质,使甘露聚糖从细胞壁上分离而溶于溶液中,以达到与B-D-葡聚糖分离提高其纯度的效果。实验结果如图6所示, Protex 40L的去蛋白效果最好,反应中需要注意的是酶解完全后要先离心去除大部分酶液,再进行灭酶处理,因为如果先进行灭酶,酶蛋白高温变性成絮状沉淀不易与B-D-葡聚糖分离开来,会导致测得的残留蛋白质含量偏高,从而使得到B-D-葡聚糖纯度下降。图6 不同蛋白酶对残留蛋白质去除效果的影响218 与传统提取方法的比较酸碱结合方法是提取B-D-葡聚糖的传统方法,它的优点在于利用甘露聚糖蛋白易溶于碱性溶液而将其去除,酸溶液可去除含有的少量杂质糖元,优于传统的酸法或碱法,因此本文参考文献采用酸碱结合的方法与上述的高温法作对比,得到的数据如表3所示。从表3中可以看出,高温法的得率和纯度高于传统方法;分子量分布结果(图7和图8)表明,传统方法会造成葡聚糖的降解,出现4个分子质量不同的峰,而采用高温法提取得到的样品分子量分布集中,基本没有发生降解。表3 不同提取方法对酵母B-D-葡聚糖得率和纯度的影响制备方法纯度/%得率/%酸碱结合63118b 21166b高温78131a 45181a图7 酸碱结合法得到样品的HPSEC分析图谱图8 高温法得到样品的HPSEC分析图谱3 结论本文采用了一种分离提取酵母细胞壁中B-D-葡聚糖新方法,与传统的酸、碱、酸碱结合的方法相比较,高温法采用了温和的提取条件,而且在产品的得率和纯度上高于传统的方法,得到最佳的提取工艺条件为pH8、料液比为1B15 (gBmL)、提取温度为120e,提取时间为3 h。参考文献1 Stefan Freimunda, Martin Sautera, OthmarKppel,i et al1A new non-degrading isolation process for 1, 3-B-D-glucanofhigh purity from baker.s yeastSaccharomyces cerevisiaeJ. 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In order to improve the purity ofB-D-glucan, lip-id extraction and enzymatic treatmentwere used to remove the remaining proteins and lipids. Finally,B-D-glucan pu-rity reached 78. 31%.Key words B-D-glucan, extraction, yeast cellwalls 政策法规标准 关于征集5蚝汁6行业标准起草单位的通知根据商办建函=2010377号文件精神,中国调味品协会(以下简称协会)将组织5蚝汁6行业标准的起草工作。为了更好的完成标准起草的任务,协会特面向全行业征集起草单位。请有意向的企业提出申请,并与协会科技部联系。中国调味品协会科技部联系方式:地址:北京市黄寺大街26号4号楼1001室;邮编: 100120;电话: 010-82809482, 010-82809483/84-802;传真: 010-82809480; e-mai:l zhtx_kjb 163. com;印发保健食品注册申报资料项目要求补充规定的通知(国食药监许201124号)根据5食品安全法6及其实施条例对保健食品实行严格监管的要求,为进一步规范保健食品注册申报与审评工作,提高保健食品质量安全控制水平,配合5保健食品产品技术要求规范6施行,国家食品药品监督管理局组织制定了5保健食品注册申报资料项目要求补充规定6,现予印发,请遵照执行。(来源:国家食药监局)8 / 8