分子诊断学：第七章 Sanger测序及高通量测序技术

临床基因组学临床基因组学第七章第七章 Sanger测序及高通量测序技测序及高通量测序技术术第一节第一节 核酸测序技术的发展核酸测序技术的发展第二节第二节 SangerSanger测序测序技术技术第三节第三节 高通量测序技术及其应用高通量测序技术及其应用 1. 了解高通量测序结果分析的流程了解高通量测序结果分析的流程 2. 掌握常见的基因突变的类型掌握常见的基因突变的类型 3. 熟悉常用的人群基因变异数据库熟悉常用的人群基因变异数据库 4. 了解常用的基因变异分析软件了解常用的基因变异分析软件 5. 了解高通量测序技术的临床应用了解高通量测序技术的临床应用高通量测序结果分析高通量测序结果分析 从头测序（de novo sequencing） 对基因组序列未知或没有近源物种基因组信息的某个物种，对其不同长度基因组DNA片段及其文库进行序列测定，然后用生物信息学方法进行拼接、组装和注释，从而获得该物种完整的基因组序列图谱。 重测序（re-sequencing） 全基因组重测序是对已知参考基因组序列的物种进行不同个体间的基因组测序，并在此基础上对个体或群体进行差异性分析。通过全基因组重测序，研究人员可以找到大量的单核苷酸多态性位点（SNP）、拷贝数变异（Copy Number Variation, CNV）、插入缺失（InDel）、结构变异（Structure Variation, SV）等变异信息高通量测序结果分析的流程 分析的起点：化学信号、荧光信号或者电流信号 原始信号转为序列信号：产生大量的reads，带有质量、位置参数 质量控制：设定一个质量门槛，排除质量差的reads或者部分序列 从头测序 重测序：将一个个质量合格的reads比对到参考序列：通过比对，找出测序结果中与参考序列不一致的序列，并且用一套命名方法进行命名高通量测序结果分析的流程（从头测序）高通量测序结果分析的流程（从头测序）高通量测序结果分析的流程（重测序）高通量测序结果分析的流程（重测序）出自：ACMG guideline (2015)高通量测序技术可检测的范围分组分组检测范围检测范围困难位点、例外困难位点、例外主要检测范围：绝大多数的点突变简单重复碱基；受到高同源序列其次：拷贝数变异；融合基因；表观遗传变异受到高同源序列干扰的区域；太短的区域需要特殊的设计与数据处理需要特殊的样本处理BADC序列比对bcl2fastq：将测序下机数据按样本分割并转为fastq格式bwa：将测序数据比对到人类参考基因组上samtools/picard：整理比对结果、标记duplicate等分析流程BADC数据库分析GATK：call SNV/indelannovar：对突变位点进行注释，例如突变在人群中的频率（千人基因组、ESP6500和dbSNP）、有无文献报道致病（HGMD）等错义突变分析：PolyPhen2; SIFT等等剪接改变的分析：NetGene2 Server; AUGUSTUS等分析流程BADC文献阅读病例报告or功能研究必要时查阅多篇文献分析流程BADC完成报告视情况对先证者的突变位点进行Sanger测序，同时对先证者家属标本进行验证撰写报告，审核并签发分析流程基因突变的注释基因突变的注释 检测到的变异需进一步进行注释，以确定其生物学意义，进行下游的分析和功能研究。 这部分主要是结合多种生物注释数据库综合分析，包括频率、结构、预测及突变数据库，每种注释方法都有其优缺点，故分析时需综合各数据库的结果判断。常用的基因变异注释分析资源类别资源简介网址基于大样本人群频率统计1000 Genomes ProjectLow-coverage whole genome sequencing of 2500 healthy humanshttp:/www.1000genomes.orgNHLBI Cohort6500 Sequenced exomes from heart, lung, and blood disorder patientshttps:/esp.gs.washington.edu/drupal/HapMap ProjectSNP-based data set to define haplotypes across 270 ethnically diverse humans http:/hapmap.ncbi.nlm.nih.gov基于结构分析SnpEffVariant impact on codon and gene structurehttp:/ impact on gene, transcript, protein sequencehttp:/www.ensembl.org/info/docs/tools/vep/index.html基于生物信息学预测SIFTSequence conservationhttp:/sift.jcvi.org/POLYPHENPhylogenetic and structural characteristicshttp:/genetics.bwh.harvard.edu/pph/CONDELMeta-prediction aggregatorhttp:/ forest prediction methodhttp:/mutpred.mutdb.org/CADDMeta-prediction and annotation scorehttp:/cadd.gs.washington.eduVAASTPhylogenetic and disease-based conservationhttp:/www.yandell-lab.org/software/vaast.htmlMutationTasterMeta-data type integrationhttp:/www.mutationtaster.orgANNOVARMeta-data, meta-prediction aggregatorhttp:/www.openbioinformatics.org/annovar/循证研究OMIMDisease phenotypegene relationshipshttp:/www.omim.orgLeiden Open Variation Database http:/www.lovd.nl/3.0/homeHuman Gene Mutation DatabaseHuman inherited disease gene lesionshttp:/www.hgmd.orgClinVarClinical human variation to phenotype relationshipshttp:/www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/ 千人基因组计划（1000 Genomes Project, 1000G） 国际千人基因组计划主要由中国、英国、美国等多个国际协作完成。 2012年，自然杂志报道了1092个人类基因组序列。 NHLBI Cohort (ESP6500) NHLBI美国国家心脏、肺、血液研究所 6503个样本： 2203 African-Americans 4300 European-Americans基因结构简图基因结构简图基因变异类型与命名基因变异类型与命名 替代变异（substitutions） 外显子区：c.203TC 内含子区：c.89-1GT 缺失变异（deletion） c.450delT c.25_27delTCA 重复突变（duplications） c.7_8dupAT 插入突变（insertions） c.112_117indelsTGDNADNA水平命名水平命名蛋白质水平蛋白质水平 错义突变p.Trp26Cys 同义变异c.162CG（p.=） 起始密码子(Met1)变异：P.Met1？ 缺失变异（deletions）p.Gln8delp.Gly4_Gln6del 重复突变（duplications）p.Gln8dupp.Gly4_Gln6dup 无义突变P.Trp26X 插入变异（insertions） p.Lys2_Leu3insGlnSer 插入/缺失变异（indels） p.Cys28_Lys29indelsTrp 框移变异（frame shifts） p.Arg97fs 插入变异（insertions） p.Gly4_Gln6dupPolyphen蛋白预测 结果分析剪接预测相关网站及使用网站 http:/spliceport.cs.umd.edu/SplicingAnalyser.html http:/www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/http:/www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/ 在CBS网站，正常序列结果如下： Donor：350 confidence：0.76 说明剪接位点在350处,序列为atcaggtaggac 基因变异临床解释指南：美国遗传学与基因组学学会指南基因突变/变异Pathogenic（病理性的）Likely pathogenic （可疑病理性的）Uncertain significance (VUS)（意义未明的）Likely benign（可能良性的）Benign（良性的）良性的或者不清楚的用“变异”强力证据支持性证据支持性证据中等强度证据强证据极强证据群体研究数据MAF is too high for disorder BA1/BS1 OR observation in controls inconsistent with disease penetrance BS2Absent in population databases PM2Prevalence in affecteds statistically increased over controls PS4计算机预测Multiple lines of computational evidence suggest no impact on gene/gene product BP4Missense in gene where only truncating cause disease BP1Silent variant with non-predicted splice impact BP7In-frame indels in repeat w/out known function BP3Multiple lines of Computational evidence support a deleterious effect on the gene /gene product PP3Novel missense change at an amino acid residue where a different pathogenic missense change has been seen before PM5Protein length changing variant PM4Same amino acid change as an established pathogenic variant PS1Predicted null variant in a gene where LOF is a known mechanism of disease PVS1功能学研究Well-established functional studies show no deleterious effect BS3Missense in gene with low rate of benign missense variants and path. missenses common PP2Mutational hot spot or well-studied functional domain without benign variation PM1Well-established functional studies show a deleterious effect PS3共分离家系研究Nonsegregation with disease BS4Co-segregation with disease in multiple affected family members PP1新发突变De novo (without paternity & maternity confirmed) PM6De novo (paternity and maternity confirmed) PS2等位基因上的其他变异Observed in trans with a dominant variant BP2Observed in cis with a pathogenic variant BP2For recessive disorders, detected in trans with a pathogenic variant PM3其他数据库Reputable source w/out shared data = benign BP6Reputable source = pathogenic PP5其他研究Found in case with an alternate cause BP5Patients phenotype or FH highly specific for gene PP4对应报告单中的对应报告单中的“阳性阳性”对应报告单中的对应报告单中的“可疑阳性可疑阳性”测序结果解读测序结果解读对应报告单中的对应报告单中的“阴性阴性”对应报告单中的对应报告单中的“未知意义未知意义”案例：SCN1A杂合变异 患者：2岁，症状较轻，有热性惊厥，无咖啡牛奶斑 突变：p.Ala1262Val 问题：该突变未见有报道证据4：PP3Polyphen-2：疑似影响功能证据1：PS2家系分析：发现患者的突变为新发突变证据2：PM2未见报道，正常人数据库少见证据3：PP2SCN1A基因的致病突变中，错义突变相当常见；错义突变中，很大比例是已知的致病的。ClinVar database:773种SCN1A变异被收录，其中错义变异533种:Benign/likely benign: 5Path./likely path.: 289Conflicting: 1VUS: 112Not provided: 120Likely PathogenicLikely Pathogenic基因测序技术的临床应用基因测序技术的临床应用筛选疾病候选基因筛选疾病候选基因遗传病的临床诊断遗传病的临床诊断肿瘤检测中的应用肿瘤检测中的应用无创性产前诊断无创性产前诊断3岁9个月，男患儿肺炎；支原体感染；大头畸形，眼窝深陷，睑裂长，鼻梁低平，鸡胸，脐疝，爪形手，胎痣，肝大，右肾囊状影粘多糖症？父母近亲结婚无家族史案例分享C一、测序数据初步分析一、测序数据初步分析IDUAchr4: 995865_995874c.888_897del p.Tyr296*IDUA基因 IDUA基因与粘多糖病1型相关，出生时无明显症状，可能有脐疝或腹股沟疝，1岁内开始出现症状，表现为脑积水引起大头，心瓣膜异常，面容异常（粗），肝脾肿大，进行性发育迟缓，体矮，智力低下，胸廊畸形结论：阳性，检测到符合临床情况的致病变异 IDUA c.888_897del p.Tyr296* 纯合 病理性变异 该变异在cDNA水平引起一段9个碱基的缺失，在蛋白水平引起第296位Tyr密码子变异为翻译的终止信号，使得所编码的蛋白被截断从而影响生物学功能。该变异尚未见报道，也并非已知的SNP位点。IDUA基因的失功能型的变异被认为与粘多糖症有关。 综合考虑，该变异为病理性变异。 解释： 检测到该受检者的IDUA基因的一个纯合的病理性变异，该变异可引起粘多糖症1型，遗传方式为常染色体隐性遗传。 患者的父母亲均为携带者，每次生育子女有25%的患病风险。基因测序技术的临床应用 筛选疾病候选基因筛选疾病候选基因 遗传病的临床诊断遗传病的临床诊断 无创性产前诊断无创性产前诊断 前段时间著名影星Angelina Jolie自爆已接受预防性双侧乳腺切除术，因为她本人罹患乳腺癌的风险极高。 38岁的美国女星Angelina Jolie在纽约时报上发表了我的医疗选择一文，称由于自己携带有 BRCA1基因，医生估计她患上乳腺癌的风险高达87%，患上卵巢癌的风险高达50%，她母亲在56岁时死于癌症。朱莉说切除术后，她患上乳腺癌的风险已降至5%。 日后，有与安吉丽娜朱莉同样担忧的女性就可以借助 NGS技术进行BRCA检测，提早采取相关措施。基因测序技术的临床应用 筛选疾病候选基因筛选疾病候选基因 遗传病的临床诊断遗传病的临床诊断 肿瘤检测中的应用肿瘤检测中的应用 在产前诊断方面（ prenatal diagnosis），以新一代测序技术为依托的创新检测手段也将会彻底改变传统的诊疗模式。 目前非侵入式的产前检测手段（non invasive prenatal test），能够诊断21三体综合症（trisomy 21）。只需要抽取孕妇一点点血液，检测其中微量的胎儿21号染色体就够了。这种非侵入式的产前检测手段，以及类似的检测13三体或者18三体综合症的检测手段都具有非常高的敏感度和特异性，一定能够在产前检查领域里找到自己的位置临床应用规范与要求临床应用规范与要求 与常规的基因检测技术相同的要求 由于技术特点带来的特殊要求 大量的生物信息学处理过程 检测技术的局限性高通量测序临床应用的质量控制规范起草机构 美国医疗保险与医疗救助服务中心（Center for Medicare and Medicaid Services，CMS）的临床实验室改进法案（Clinical Laboratory Improvement Amendments，CLIA） 美国病理学家协会（College of American Pathology，CAP） 美国疾控中心（CDC） 美国医学遗传学学会（ACMG） 临床实验室标准化协会（CLSI）