青海省麦类黄矮病发生情况调查

青海省麦类黄矮病发生情况调查收稿日期：2015-02-27基金项目：国家公益性行业(农业)科研专项(编号：201303021)。通信作者：郭青云，硕士，研究员，从事植物保护研究。E-mail：guoqingyunqh163。麦类黄矮病是由大麦黄矮病毒(BYDVs)引起、由蚜虫传播的一种全球性病毒病1，寄主广泛，不仅侵染小麦、大麦，还危害燕麦、玉米、水稻等禾本科作物2-5，在小麦上的常见症状是植株矮化、抽穗率降低，叶片从叶尖开始失绿黄化，后逐渐干枯，而下部植株仍为绿色6。BYDV驻要有4种株系类型，分别为GAVGPVPAVRMV其传毒介体蝇虫分别为麦二叉螃(Schizaphisgramium)和麦长管财(Sitobionavenae)2种、麦二叉蚜和禾谷缢管蚜(Rhopalosiphumpadi)2种、禾谷缢管蚜、麦长管蚜和麦二叉蚜3种及玉米蚜1种7。目前，防控黄矮病仍以防治麦蚜为主，没有表现突出的抗病毒药剂8-9。青海省地处青藏高原，麦类作物种植区主要集中在东部季风区，海拔从16502000m,气候区分布差异大，垂直变化明显。河惶是麦类作物生长的主要地区，年平均温度在-6-4C,68月平均温度为5.419.8C,特殊的气候条件导致麦类病害的发生规律更为复杂，不同于其他地区。翟浩等2010年对青海省东部小麦调查发现，2010年黄矮病在青海中度发生，西宁、贵德、乐都、互助地区小麦黄矮病主要流行株系为GAV10。近年来，青海省除种植小麦外，最多的麦类作物为青稞，栽培燕麦种植面积也越来越大。全面了解青海省麦类作物黄矮病的发生情况，系统了解青海省传毒介体蚜虫与黄矮病的发生规律，对黄矮病的防治具有指导作用，也可为抗病育种提供一些理论基础。1 材料与方法1.1 调查地点概况选择青海省互助县、贵德县、循化县3个不同气候特征的地区作为麦蚜及小麦黄矮病系统调查的地点，其中，互助县调查点为春麦，贵德县和循化县调查点为冬麦。麦类黄矮病样本采集地除这3个地区外，还包括西宁市、湟中县、海北州（表1）。1.2 蚜虫发生种类与优势种调查冬麦从3月初、春麦从5月底开始，各调查点每10d左右从田间采集蚜虫进行室内蚜种鉴定，统计各蚜虫数量，判定优势种。1.3 麦蚜越冬调查冬麦区从冬麦出苗开始，定期到田间观察麦苗上的蚜虫情况，挖取小麦根部土层检查有没有蚜虫；春麦区从小麦收割后开始，定期查看小麦残茬根部自生麦苗及禾本科杂草蚜虫的发生情况。1.4 蚜虫消长规律调查根据品种、播期、地势、作物长势等，选择有代表性的麦田44.7hm2,采用平行线抽样法选取10点，每点在1行中等距离取10株，共100株。冬麦区从3月1日开始至小麦收割，春麦区从4月上旬开始至小麦收割，每5d调查1次，统计百株蚜量、有翅蚜与无翅蚜比例11。1.5 小麦黄矮病病情调查春麦区从田间出现病株开始，一直调查到小麦乳熟期，包括发病率和病情指数。调查时，如为黄矮病发生流行年，按5点取样，如为一般发生年份，应调查田块发病中心数及大小，田间发病率调查取样应包括麦田边行样点，以避免因取样所造成的误差。黄矮病病株的病情采用5级分级：0级：健株；1级：部分叶片尖端变黄；2级：旗叶12片叶叶尖黄化；3级：旗叶黄化面积占旗叶总面积的1/2以下，其他叶片黄化面积占总叶面积的1/2以下；4级：旗叶黄化面积占旗叶总面积的1/2以下，其他叶片黄化面积占总叶面积的1/2及以上；5级：几乎所有叶片完全黄化，植株矮化显著，穗变小甚至不抽穗12。1.6 青海省麦类黄矮病发生株系调查1.6.1 田间病样采集与识别2014年，于小麦、青稞、栽培燕麦、野燕麦抽穗期，在青海省西宁市、贵德县、循化县等田间采集疑似黄矮病样本，记录采集日期、地点、寄主、样品数及发病症状，分别编号（表2），-80保存。麦类黄矮病识别症状：病株较健株稍矮，抽穗较晚，穗头较小；明显症状是叶片失绿，旗叶及上部叶片最先表现症状；小麦、青稞病叶是从叶尖开始发黄，质地光滑，后期逐渐黄枯；栽培燕麦、野燕麦病叶从叶尖开始发黄变红，质地变硬。1.6.2 病毒株系鉴定1.6.2.1 试剂JUNIQ-10柱式Trizol总RN内由提试剂J盒，购自生工公司(SangonBiotech)；RevertAidTM第一链cDNASynthesis试剂盒、TaqDNApolymerase5U/L和dNTPmixture2.5mmol/L,购自Thermo公司。1.6.2.2 病毒RN屣取取植物叶片组织，在装有液氮的研钵中充分研磨；取0.1g样品，加1mLTrizol，混匀，室温放置510min使核蛋白与核酸完全分离；加入400以L氯仿，剧烈振荡30s，室温放置3min；12000r/min、4离心10min；取上层水相600以L,转移至干净的离心管中，加入300以L无水乙醇，混匀；将吸附柱放入收集管中，用移液器将溶液和半透明纤维状悬浮物全部加入吸附柱中，静置2min，12000r/min离心3min，倒掉收集管中废液；将吸附柱放回收集管中，加入500以LRPESolution,静置2min,10000r/min离心30s,倒掉收集管中废液，重复1次；将吸附柱放回收集管中，10000r/min离心2min；将吸附柱放入干净的1.5mL离心管中，在吸附膜中央加入30以LDEPC-treatedddH2Q静置5min,12000r/min离心2min；-20暂存，-70长期保存。1.6.2.3提取的RN颇量测定把提取的RNA释200倍，即398DEPC-treatedddH2O+2以LRNA,使用核酸蛋白测定仪测量RNA质量。1.6.2.4 引物设计与合成根据GenBank己报道的BYDV因组序列13设计引物（表3）,由上海生工生物工程XX公司进行合成。1.6.2.5 RT-PCR扩增按照Thermo使用说明书进行反转录反应：0.2mLRNase/DNase-free的离心管中加入DEPC-treatedH2O4以L、反向引物1以L、病毒RNA1以L,短暂离心混匀，65c孵育5min,立即置于冰上；依次加入5XReactionbuffer2以L、10mmol/LdNTPMix1以L、20U/以LRiboLockTMRNA酶抑制剂0.5以L、200U/以LRevertAidTMM-MuLV逆转录酶0.5以L,短暂离心混匀，42C温育1h,70C灭活10min,-20保存备用。PC阪应液，总体积50以L:10XPCRbuffer5L;2.5mmol/LdNTPMixture2以L;10以mol/L正向引物1以L;10以mol/L反向引物1以L;反转录cDNA5以L;TaqDNApolymerase0.25以L;ddH2O36以L。在BIO-RADS1000PCR仪上进行扩增，反应条件为：94预变性2min；94变性2min，52退火1min，72延伸1min，30个循环；7210min，4保存。取PCR&应产物5以L进行1%琼脂糖凝胶电泳分析。2结果与分析2.1 蚜虫种类和优势种由表4至表6可见，青海省小麦上发生的蚜虫种类有麦长管蚜、麦二叉蚜和禾谷缢管蚜，其中优势种为麦长管蚜，禾谷缢管蚜发生较少；麦长管蚜在小麦整个生长期均有危害，穗期发生量相对最大；麦二叉蚜主要危害小麦叶片。1.6.2.6 麦蚜的越冬调查2013年9月至2014年12月，对互助地区春麦收割后蚜虫发生情况进行定期调查，结果显示，春麦区麦蚜小麦收割前蚜量急剧降低，部分迁移到田边禾本科杂草上，场量为050头/百株；10月春麦田自生麦苗生长期，自生麦苗上百株蚜量为0200头，且螃虫主要集中在接近土壤的茎根部；11、12月份，随着气温降低，自生麦苗被冻死，田间已观察不到蚜虫，直至来年4月份挖取小麦根部土壤，均没有发现蚜虫；5月，春麦上最初发现的麦蚜中，有翅蚜占有绝大比例。冬麦区，2013年11月至2014年3月调查结果显示，11月份小麦秋苗上蚜量为0100头/百株，并随气温降低，场量逐渐减少；12月初到来年3月中旬，土层上部小麦植株上观察不到蚜虫；3月上旬，挖取小麦田土壤检查，在小麦根部土壤检查到绿色的低龄若蚜，且集中在向阳的田边，这说明麦蚜在青海省冬麦种植区可以存活越冬，可能是来年黄矮病传毒介体的重要虫源。2.3 蚜虫的消长规律调查由表4至表6可见，冬麦区小麦，3月中旬小麦返青期开始在叶片上出现蚜虫，且均为无翅蚜；5月上旬小麦抽穗早期，百株蚜量在100头以内，蚜量缓慢增长；6月上旬小麦灌浆期，田间蚜量迅速增多，百株蚜量在6000头左右，田间蚜量高峰出现，此时90%的蚜虫集中在小麦穗部取食，叶片部位危害的基本上为二叉蚜；6月下旬，随着小麦进入蜡熟期，蚜虫群体密度又迅速减退，百株蚜量在1000头左右，并且有翅蚜比例上升；小麦进入成熟期，植株干枯，麦蚜逐渐迁移到其他寄主上或其他地方。春麦区小麦，5月下旬小麦拔节期才观察到蚜虫迁入小麦田，且98%均为有翅蚜；直到6月中旬，蚜虫群体密度均较低，百株蚜量不足2头；7月中下旬，蚜量突增，达到高峰，但相比冬麦区，麦蚜发生量较小，百株蚜量在800头左右；8月中旬开始，小麦进入成熟期，蚜量又迅速降低，有翅蚜增多。2.4 小麦黄矮病病情调查由图1至图3可见，青海省贵德、循化冬麦区，3月底田间小麦开始出现有黄矮病症状的病株；6月中旬小麦灌浆期，田间小麦黄矮病病情指数达到最高，病株率达到高峰；循化县小麦黄矮病病情稍低于贵德县，2013、2014年病情指数最高分别为3.5、6.9，病株率最高分别在4.9%、7.9%左右，根据相建业等对黄矮病的分级标准12，青海省2013年冬麦区小麦黄矮病为轻度发生年，2014年为轻度流行年。青海省互助县春麦区，6月上旬小麦孕穗期开始观察到病株出现，8月上旬小麦蜡熟期，小麦黄矮病发病达到高峰，2013、2014年病情指数最高分别为3.78、3.87，田间病株率分别在4.07%、7.74%左右，青海省2013年春麦区小麦黄矮病为轻度发生年，2014年为轻度流行年。在调查过程中还发现，小麦有病植株较正常植株矮小，穗头较小，穗部轻微弯曲；重病植株不能抽穗，较早黄化、干枯、死亡；小麦黄矮病在田间发病不均匀，不同田块病情差异较大。2.5青海省麦类黄矮病发生株系调查病叶样本提取的总RNAS过核酸蛋白测定仪进行质量检测，D260nm/D280nm值均在2.0左右，这说明提取的样本总RNA屯度满足试验要求，可用作逆转录反应的模板。提取的病叶样本RNAg过RT-PCRT增，并进行1%琼脂糖凝胶电泳发现，被不同病毒株系侵染发病的叶片均扩增出各自的特异性目的条带，而健康的小麦叶片则没有特异性条带出现（图4），这说明RT-PCR具有特异性，扩增结果与预期相符。由表7可见，大麦黄矮病毒在青海省麦类主要种植区均有发生，并且小麦、青稞、栽培燕麦、野燕麦均能感病；青海省大麦黄矮病流行株系为GAV另外有少数病株为GAVfPAV复合侵染，没有PAV单独侵染，也没有GPVft系发生。3结论本研究系统调查了青海省小麦黄矮病发生严重程度、大麦黄矮病毒株系、传毒介体蚜虫的发生情况等，为该地区小麦黄矮病的防治提供了理论依据。调查结果显示，青海省2013表72014年青海省麦类黄矮病株系检测采集地点寄主样品份数GAVGPVPAV病西宁市小麦1818000西宁市青稞2524001西宁市栽培燕麦1717000西宁市野燕麦1010000贵德县小麦3130010贵德县野燕麦1515000循化县小麦3230020互助县小麦3535000互助县青稞2726010互助县栽培燕麦1211010湟中县小麦3232000湟中县青稞3028020湟中县野燕麦1010000海北州西海镇青稞3330030总计327316（99.68%）010（3.15%）12014年麦类黄矮病发生相对较轻，病毒流行株系为GAV，少量有PAV复合侵染，这与翟浩等在2010年对青海省大麦黄矮病株系检测的结果8吻合；传毒介体麦蚜优势种为麦长管蚜，麦二叉蚜有少量发生，禾谷缢管蚜零星发生；麦蚜在青海省冬麦区可以越冬，蚜量在小麦抽穗期达到高峰。从贵德县、循化县、互助县麦蚜开始发生危害的时间和相应地区小麦黄矮病开始发病的时间来看，麦蚜开始危害与小麦黄矮病发病均相差20d左右，这说明黄矮病在该地区的潜伏期为20d左右。从各调查点蚜量和对应地区黄矮病的病情指数，结合杨菲等检测青海省贵德地区蚜虫带毒率为75%左右的结论14可以看出，蚜量影响黄矮病的严重程度，防治麦蚜是防治黄矮病的关键，冬麦区控制拔节期麦蚜、春麦区控制孕穗期麦蚜是防治小麦黄矮病的关键时期。青海省主要麦类作物包括小麦、青稞、栽培燕麦等均有黄矮病发生，尤其近几年，栽培燕麦逐渐有大面积的种植，这就要求青海省在筛选当地抗黄矮病农作物的同时，要全面考虑品种结构，进行合理布局，才能达到减轻病害的目的