自噬线粒体自噬在锌诱导的抗心肌细胞缺氧复氧损伤保护中的作用

自噬/线粒体自噬在锌诱导的抗心肌细胞缺氧/复氧损伤保护中的作用目的1.观察ZnCl2是否通过诱导自噬/线粒体自噬来减轻心肌细胞缺氧/复氧引起的活性氧（ROS产生并保护心肌细胞。2.探讨ZnCl2诱导自噬/线粒体自噬的分子机制。方法建立心肌细胞H9c2缺氧/复氧模型。用透射电镜观察线粒体的结构和功能改变、线粒体自噬泡的形成情况;Westernblotting法检测LC3、TOM2、0TIM23、COX、4Beclin1、PINK1蛋白表达及ERK、mTOR、AMP、KBcl-2磷酸化水平;qPCR检测NIX和PINKImRNAK平的改变；用免疫荧光法检测GFP-LC3自噬体和TOM20的共定位、MitotrackGreen（MTG）和PINK1的共定位;用线粒体荧光探针JC-1、RO观光探针DCFH-DA线粒体RO嵌光探针MitosoxRed在共聚焦显微镜上分别测定线粒体膜电位（Mitochondrialmembranepotential,AWm细胞内总ROSffi线粒体RO冰平。结果1.共聚焦显微镜实验结果显示。与正常对照组相比,复氧时细胞和线粒体内的ROSS显增加。用ZnCl2处理细胞可减少ROSK平,表明ZnCl2可减少复氧时线粒体ROS勺产生。2.在正常生理条件下,H9c2细胞经不同浓度的ZnCl2处理后,LC3-II水平均明显升高，其中以5M最为明显。用GFP-LC既粒”专染H9c2细胞48h后，用ZnCl2处理细胞使GFP-LC狄光明显增强。另外Rapamycin（20M）和饥饿（8h）也使LC3-II水平升高，这种作用可被选择性ZnCl2螯合齐【JTPENff逆转。抑制剂BafilomycinAl(BA1)可进一步促使LC3-II水平升高，表明ZnCl2可增力口自噬流。3.免疫荧光实验结果显示,用GFP-LC既粒”专染H9c2细胞48h后,ZnCl2使GFP-LC3自噬体与线粒体外膜蛋白TOM20勺共定位明显增加，表明在生理条件下ZnCl2可诱导线粒体自噬。电镜检查结果显示,未经处理的细胞,线粒体正常分布于细胞内,用锌离子处理细胞30min后,部分线粒体被自噬体包裹。Westernblotting分析结果显示线粒体标志性蛋白包括外膜蛋白TOM2、0内膜蛋白TIM23和COX4勺表达土下降，进一步证明ZnCl2可诱导线粒体自噬。4.在缺氧/复氧条件下，ZnCl2增加GFP-LC3自噬体与线粒体外膜蛋白TOM20勺共定位。电镜结果显示,缺氧/复氧使线粒体断裂,线粒体移位,空泡化增多,可见自噬体;而ZnCl2处理组,线粒体水月中空泡化减少，自噬体，自噬溶酶体，自噬体包裹线粒体增多。另外，ZnCl2使TOM20TIM23和COX4勺表达均降低，使LC3-II水平明显升高，表明复氧时ZnCl2可促进线粒体自噬,清除损伤的线粒体。5.在缺氧/复氧模型中,ZnCl2处理H9c2细胞后,TOM20、TIM23和COX45白水平明显降低，而LC3-II水平则明显升高，ZnCl2的这些作用可被自噬抑制剂3-MA所抑制。同时，自噬抑制剂3-MA可抑制ZnCl2对细胞RO辱口线粒体ROS勺影响，表明ZnCl2通过诱导自噬/线粒体自噬发挥其抗氧化应激作用。6.Western blotting 结果显示 , 与缺氧 / 复氧组相比,ZnCl2 促进ERKS酸化,使LC3-II水平升高,促进TOM20TIM23和COX4勺降解ZnCl2的这些作用可被MEK卬制齐IJPD98059所抑制，表明ERK信号通路参与ZnCl2诱导的自噬/线粒体自噬。在缺氧/复氧模型中,ZnCl2使Beclin1和LC3-II水平升高,使TOM20TIM23和COX俵达下降，而这些作用被BeclinlsiRNA所抑制，表明Beclinl参与ZnCl2诱导的自噬/线粒体自噬。另外,PD98059可抑制ZnCl2对Beclinl表达和Bcl-2磷酸化的影响，表明在ZnCl2诱导自噬的过程中，ERK位于Beclin1和Bcl-2的上游。7 .在缺氧/复氧模型中，ZnCl2可促进线粒体TOM20TIM23和COX俵达下降，而这些作用可被PINK1siRNA所抑制。免疫荧光实验结果显示,ZnCl2使Mitotracker(MTG与PINK1的共定位增加，而该效应被PD9805的阻断，表明PINK1参与ZnCl2诱导的线粒体自噬过程且可能位于ERKF游。8 .ZnCl2减少复氧时ROSdC平，而该作用被Beclin1siRNA和PINK1siRNA所抑制，表明Beclin1和PINK1均参与ZnCl2的抗氧化应激作用。9.ZnCl2可减少缺氧/复氧引起的线粒体膜电位的降低,增加细胞活性。ZnCl2的这种作用被Beclin1siRNA和PINK1siRNA所逆转，表明Beclin1和PINK1均参与ZnCl2抗缺氧/复氧损伤的保护作用。结论1、ZnCl2可减轻心肌细胞复氧时ROS勺爆发及氧化应激损伤，进而保护心肌细胞。粒体，进而防止线粒体ROS勺产生。3、ZnCl2通过ERKBeclinl及PINK1信号通路来诱导心肌细胞自噬/线粒体自噬。2、ZnCl2通过诱导心肌细胞自噬及线粒体自噬而消除损伤的线