免疫荧光技术操作步骤(共1页)

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精选优质文档-倾情为你奉上免疫荧光技术操作步骤 直接免疫荧光法测抗原 基本原理 将荧光素标记在相应的抗体上,直接与相应抗原反应。其优点是方法简便、特异性高,非特异性荧光染色少,相对使用标记抗体用量偏大。 试剂与仪器 磷酸盐缓冲盐水(PBS):0.01mol/L,pH7.4 荧光标记的抗体溶液:以 0.01mol/L,pH7.4 的 PBS 进行稀释 缓冲甘油:分析纯无荧光的甘油 9 份+ pH9.2 0.2M 碳酸盐缓冲液 1 份配制 搪瓷桶三只(内有 0.01mol/L,pH7.4 的 PBS 1500ml) 有盖搪瓷盒一只(内铺一层浸湿的纱布垫) 荧光显微镜 玻片架 滤纸 37温箱等。 实验步骤 1. 滴加 0.01mol/L,pH7.4 的PBS于待检标本片上,10min后弃去,使标本保持一定湿度。 2. 滴加适当稀释的荧光标记(饱和浓度可以用滴度发或公式法算出)的抗体溶液,使其完全覆盖标本,置于有盖搪瓷盒内,保温30min 定时间(参考:30min)。 3. 取出玻片,置玻片架上,先用 0.01mol/L,pH7.4 的 PBS 冲洗后,再按顺序过 0.01mol/L,pH7.4 的 PBS 三缸浸泡,每缸 3-5 min,不时振荡。 4. 取出玻片,用滤纸吸去多余水分,但不使标本干燥,加一滴缓冲甘油,以盖玻片覆盖。 5. 立即用荧光显微镜观察。观察标本的特异性荧光强度,一般可用“+”表示: (-)无荧光;()极弱的可疑荧光;(+)荧光较弱,但清楚可见;(+)荧光明亮;(+ -+)荧光闪亮。待检标本特异性荧光染色强度达“+”以上,而各种对照显示为()或(-),即可判定为阳性。注意事项1. 对荧光标记的抗体的稀释,要保证抗体的蛋白有一定的浓度,一般稀释在 1:20-100 之间,要自行摸索最佳梯度,建立最好的稀释比例,抗体浓度过低,会导致产生的荧光过弱,影响结果的观察。 2. 染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化,染色时间可以从 10 min 到数小时,一般 30 min 已足够。染色温度多采用室温(25左右),高于 37可加强染色效果,但对不耐热的抗原(如流行性乙型脑炎病毒)可采用 0-2的低温,延长染色时间。低温染色过夜较 3730 min 效果好的多。 3. 为了保证荧光染色的正确性,首次试验时需设置下述对照,以排除某些非特异性荧光染色的干扰。 (1)标本自发荧光对照:标本加 1-2 滴 0.01mol/L,pH7.4 的 PBS。 (2)特异性对照(抑制试验):标本加未标记的特异性抗体,再加荧光标记的特异性抗体。 如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光, 待检标本呈强荧光,则为特异性阳性染色。 4. 一般标本在高压灯下照射超过 3min,就有荧光减弱现象,经荧光染色的标本最好在当天观察,随着时间的延长,荧光强度会逐渐下降。专心-专注-专业
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