二硫键检测方法

2.3.1.4 MBP-Permatin蛋白中半胱氨酸残基及二硫键数目的测定L半胱氨酸可于5,5-二硫基双-2硝基甲苯(DTNB)发生硫醇-二硫 化物交换反应，在碱性条件下反应显黄色，在412 nm处有强烈吸收峰。 该反应可特异地检测-SH,从而定量检测L半胱氨酸含量。分析MBP标签氨基酸序列可知，该标签蛋白中不含有半胱氨酸, 故不影响原核表达的Pcrmatin中半胱氨酸残基的数目。采用DTNB 方法测定样品的疏基数，其方法的主要步骤为：1) 样品先用8M尿素37C处理4h;2) 游离疏基数的测定:向未经尿素处理的1.0 ml样品(0.38 mg/ml)中加入 2 ml Tris-Gly(0.086 M Tris, 0.09 M Glv, pH 8.0),加入 5()ll 1 DTNB(1() mM DTNB, 200 mM Tris-HCl, pH 8.0), 5 min 后测定 412 nm 处的吸光值；3) 总的硫基数的测定：向经尿素处理的().5 ml样品中加入2 ml Tris-Gly,加入 50pl 卩-疏基乙醇(p-ME), 37C 温浴 lh,加入 10 ml 12%三氯乙酸(TCA), 37C 温浴 1 h, 11000 rpm 离心 3() min,用 5 ml 12% TCA重悬沉淀两次，以彻底去除3-ME,最后用2ml Tris-Gly重溶 沉淀，加入501 DTNB溶液，5 min后测定412 nm处的吸光值。利用公式：pmol SH/g=73.53XA412XD/C迸行计算。其中 A2是412 nm处的吸光值，D为稀释倍数，C为蛋白浓度,73.53是一 个系数，由106/1.36 x 104得到。如有侵权请联系告知删除，感谢你们的配合！精品