生物化学 14章 核酸物理化学性质

Chapter14 核酸的物理化学性质核酸的物理化学性质核酸的水解核酸的水解酸碱性质酸碱性质紫外吸收紫外吸收变性和复性变性和复性本章要点本章要点一、核酸的水解一、核酸的水解（一）酸水解或碱水解（一）酸水解或碱水解l核酸分子中的磷酸二酯键可在酸或碱性条件下水核酸分子中的磷酸二酯键可在酸或碱性条件下水解切断。解切断。lDNADNA和和RNARNA对酸或碱的耐受程度有很大差别。对酸或碱的耐受程度有很大差别。DNADNA一般对碱稳定，一般对碱稳定，RNARNA对碱不稳定。对碱不稳定。（一）核酸的酸水解或碱水解（一）核酸的酸水解或碱水解例如，在例如，在0.1 mol/L NaOH0.1 mol/L NaOH溶液中，溶液中，RNARNA几乎可以完几乎可以完全水解，生成全水解，生成22或或33磷酸核苷；磷酸核苷；DNADNA在同样条件在同样条件下则不受影响。下则不受影响。一、核酸的水解一、核酸的水解在在RNA水解时，水解时，2-OH首先进攻磷首先进攻磷酸基，在断开磷酯酸基，在断开磷酯键的同时形成环状键的同时形成环状磷酸二酯，再在碱磷酸二酯，再在碱的作用形成水解产的作用形成水解产物。物。（二）酶水解（二）酶水解l生物体内存在多种核酸水解酶。这些酶可以催化水解生物体内存在多种核酸水解酶。这些酶可以催化水解多聚核苷酸链中的磷酸二酯键。多聚核苷酸链中的磷酸二酯键。l以以DNADNA为底物的为底物的DNADNA水解酶（水解酶（DNasesDNases）和以）和以RNARNA为底物为底物的的RNARNA水解酶（水解酶（RNasesRNases）。）。一、核酸的水解一、核酸的水解（二）酶水解（二）酶水解根据作用方式可分作两类：根据作用方式可分作两类：核酸外切酶核酸外切酶和和核酸内切酶核酸内切酶。a)a) 核酸外切酶核酸外切酶的作用方式是从多聚核苷酸链的一端（的作用方式是从多聚核苷酸链的一端（33端端或或55端）开始，逐个水解切除核苷酸；端）开始，逐个水解切除核苷酸；b)b) 核酸内切酶核酸内切酶的作用方式刚好和外切酶相反，它从多聚核苷的作用方式刚好和外切酶相反，它从多聚核苷酸链中间开始，在某个位点切断磷酸二酯键。酸链中间开始，在某个位点切断磷酸二酯键。l在分子生物学研究中最有应用价值的是在分子生物学研究中最有应用价值的是限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶。这种酶可以特异性的水解核酸中某些特定碱基顺序部位。这种酶可以特异性的水解核酸中某些特定碱基顺序部位。一、核酸的水解一、核酸的水解限制性核酸内切酶具有严格的碱基专一性，有专一的识限制性核酸内切酶具有严格的碱基专一性，有专一的识别顺序、切点别顺序、切点 二、核酸的酸碱性质二、核酸的酸碱性质v 与蛋白质相似，核酸分子中既含有酸性基团（磷酸基）与蛋白质相似，核酸分子中既含有酸性基团（磷酸基）也含有碱性基团（碱基），因而核酸也具有也含有碱性基团（碱基），因而核酸也具有两性性质两性性质。v 由于核酸分子中的磷酸是一个中等强度的酸，而碱性由于核酸分子中的磷酸是一个中等强度的酸，而碱性（碱基）是一个弱碱，所以核酸的等电点比较低。如（碱基）是一个弱碱，所以核酸的等电点比较低。如DNADNA的等电点为的等电点为4 44.54.5，RNARNA的等电点为的等电点为2 22.52.5。v RNARNA的等电点比的等电点比DNADNA低的原因，是低的原因，是RNARNA分子中核糖基分子中核糖基2-OH2-OH通过氢键促进了磷酸基上质子的解离。通过氢键促进了磷酸基上质子的解离。DNADNA没有这种作用。没有这种作用。三、三、n在核酸分子中，由于在核酸分子中，由于嘌呤碱嘌呤碱和和嘧啶碱嘧啶碱具有具有共轭双键体系，因而共轭双键体系，因而具有独特的紫外线吸具有独特的紫外线吸收光谱，最大吸收峰收光谱，最大吸收峰波长在波长在260nm260nm处，可以处，可以作为核酸及其组份定作为核酸及其组份定性和定量测定的依据。性和定量测定的依据。三、三、 增色效应：增色效应：核酸发生变核酸发生变性时，吸光度增加的现象。性时，吸光度增加的现象。 减色效应：减色效应：复性后，吸复性后，吸光度又降低的效应。光度又降低的效应。四、核酸四、核酸的变性、复性及杂交的变性、复性及杂交( (一一) ) 核酸的变性核酸的变性(denaturation)(denaturation)1 1、核酸的变性、核酸的变性: :维系核酸三维结构的维系核酸三维结构的氢键氢键如果受到某如果受到某些理化因素的破坏，其三维结构就要改变，从而引起些理化因素的破坏，其三维结构就要改变，从而引起理化性质及生物学功能的改变，这种现象称为核酸的理化性质及生物学功能的改变，这种现象称为核酸的变性。变性。四、核酸四、核酸的变性、复性及杂交的变性、复性及杂交( (一一) ) 核酸的变性核酸的变性(denaturation)(denaturation)2 2、特征：变性核酸将失去其部分或全部的生物活性。核、特征：变性核酸将失去其部分或全部的生物活性。核酸的变性并酸的变性并不涉及磷酸二酯键的断裂不涉及磷酸二酯键的断裂，所以它的，所以它的一级一级结构结构( (碱基顺序碱基顺序) )保持不变保持不变。3 3、引起核酸变性的因素：温度升高、酸碱度改变、甲醛、引起核酸变性的因素：温度升高、酸碱度改变、甲醛、尿素尿素变性与降解的区别：是否涉及共价键的断裂和分子量的改变变性与降解的区别：是否涉及共价键的断裂和分子量的改变4、Tm值值 定义定义：加热变性使：加热变性使DNADNA的双螺旋结构失去一半时的温的双螺旋结构失去一半时的温度称为该度称为该DNADNA的熔点或溶解温度，用的熔点或溶解温度，用Tm表示。表示。 影响影响DNA DNA T Tm m大小的因素：大小的因素：DNADNA的均一性；的均一性；G-CG-C含量；介含量；介质中的离子强度。质中的离子强度。 G G和和C C的含量高，的含量高，TmTm值高。值高。因而测定因而测定TmTm值，可反映值，可反映DNADNA分子中分子中G-CG-C含量，可通过经验公式计算：含量，可通过经验公式计算： （G+CG+C）%=(Tm-69.3)X2.44%=(Tm-69.3)X2.44l当当DNADNA的稀盐溶的稀盐溶液加热到液加热到80-80-100100时，双螺时，双螺旋结构即发生旋结构即发生解体，两条链解体，两条链彼此分开，形彼此分开，形成无规线团。成无规线团。 lDNADNA变性后，它变性后，它的一系列性质的一系列性质也随之发生变也随之发生变化，如紫外吸化，如紫外吸收收(260 nm)(260 nm)值值升高升高, , 粘度降粘度降低等。低等。（G+C）%=(Tm-69.3)X2.44四、核酸四、核酸的变性、复性及杂交的变性、复性及杂交( (二二) ) 核酸的复性核酸的复性(renaturation)(renaturation)n核酸的复性核酸的复性: :变性变性DNADNA在适当的条件下，两条彼此分在适当的条件下，两条彼此分开的单链可以重新缔合成为双螺旋结构，这一过程称开的单链可以重新缔合成为双螺旋结构，这一过程称为复性。为复性。DNADNA复性后，一系列性质将得到恢复，但是生复性后，一系列性质将得到恢复，但是生物活性一般只能得到部分的恢复。物活性一般只能得到部分的恢复。四、核酸四、核酸的变性、复性及杂交的变性、复性及杂交( (二二) ) 核酸的复性核酸的复性(renaturation)(renaturation)lDNADNA复性的程度、速率与复性过程的条件有关。复性的程度、速率与复性过程的条件有关。l热变性的热变性的DNADNA骤然冷却至低温时，骤然冷却至低温时，DNADNA不可能复性。不可能复性。l变性的变性的DNADNA缓慢冷却时，可以复性。缓慢冷却时，可以复性。l分子量越大复性越难。浓度越大，复性越容易。此外，分子量越大复性越难。浓度越大，复性越容易。此外，DNADNA的复性也与它本身的组成和结构有关。的复性也与它本身的组成和结构有关。四、核酸四、核酸的变性、复性及杂交的变性、复性及杂交( (二二) ) 核酸的复性核酸的复性(renaturation)(renaturation)( (三三) ) 核酸的杂交核酸的杂交(hybridization)(hybridization)n热变性的热变性的DNADNA单链，在复性时并不一定与同源单链，在复性时并不一定与同源DNADNA互补互补链形成双螺旋结构，它也可以与在某些区域有互补序链形成双螺旋结构，它也可以与在某些区域有互补序列的异源列的异源DNADNA单链形成双螺旋结构，叫单链形成双螺旋结构，叫核酸杂交核酸杂交。四、核酸四、核酸的变性、复性及杂交的变性、复性及杂交( (三三) ) 核酸的杂交核酸的杂交 *两条两条来源不同来源不同的核酸单链间，因部分的核酸单链间，因部分碱基互补碱基互补，经退火，经退火处理可以形成杂交双螺旋结构。处理可以形成杂交双螺旋结构。如如DNA/DNA、DNA/RNA、RNA/RNA杂交分子。杂交分子。( (三三) ) 核酸的杂交核酸的杂交(hybridization)(hybridization)Southern blotting （Southern印迹法）：印迹法）：DNA-DNA杂交杂交Northern blotting （Northern印迹法）：印迹法）：DNA-RNA杂交杂交Western blotting （Western印迹法）：抗原印迹法）：抗原-抗体结合抗体结合 510页页四、核酸四、核酸的变性、复性及杂交的变性、复性及杂交Northern blottingn理解一般物理性质理解一般物理性质n掌握两性性质掌握两性性质n掌握紫外吸收掌握紫外吸收n掌握变性与复性掌握变性与复性n了解核酸的酸解与碱解了解核酸的酸解与碱解本章考点本章考点