少动鞘脂单胞菌产结冷胶发酵培养基的响应面法优化

少动鞘脂单胞菌产结冷胶发酵培养基的响应面法优化胡桂 收稿日期： 初稿； 基金项目：福建省自然科学基金项目(2007J0058) ；福建省杰出青年科学基金项目(2009J06010)；福建省省属公益类事业单位自选项目(2009R10037-4)作者简介：胡桂萍 （1985-），硕士，研究方向为微生物功能物质开发与应用(hugp_2007)通讯作者：刘波（1957-），博士, 研究员, 研究方向为微生物生物技术与农业生物药物, (fzliubo)萍，刘波*，朱育菁，史怀，刘丹莹(福建省农业科学院农业生物资源研究所，福州市，350003)摘 要：通过单因素试验分析不同碳源、氮源、无机盐对（Sphingomonas paucimobilis FJAT-5627）产胶量的影响，确定最适碳源、氮源、无机盐，并在单因素筛选试验的基础上，利用Box-Benhnken设计和响应面分析法对碳源、氮源和无机盐进行优化，得到少动鞘脂单胞菌产生结冷胶发酵培养基最佳优化组合。实验结果表明，少动鞘脂单胞菌产胶量发酵最适碳源、氮源和无机盐分别为淀粉、豆饼粉和KH2PO4。响应面法得到产胶量(Y)与碳源淀粉(x1)、氮源豆饼粉(x2)和无机盐KH2PO4 (x3)的回归方程为：Y=13.87+0.54x1+0.22x2-0.42x3-3.26x12-1.85x22-1.51x32+0.053x1x2+0.067x1x3+0.4x2x3。优化培养基组合为：淀粉浓度为30 g/L，豆饼粉浓度为5 g/L，KH2PO4的浓度为0.7 g/L，且此组合下少动鞘脂假单胞发酵得到结冷胶可达23.87 g/L。关键字：少动鞘脂单胞菌，发酵，培养基，产胶量，响应面分析法中图分类号：Q815；TS201.3 MR分类号：92C40；62J02 文献标识码：AOptimization of fermentation culture medium for producing gellan gum of Sphingomonas paucimobilis by response surface methodologyHU Gui-ping, LIU Bo*, ZHU Yu-jing, SHI Huai, LIU Dan-ying(Agricultural Biological Resource Research Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350003，China)Abstract: The effects of carbon source, nitrogen source, inorganic salt on the yield of gellan gum on the growth of Sphingomonas paucimobilis FJAT-5627 were studied by Single-factor analysis in order for gaining the optimum carbon, nitrogen and inorganic salt. The fermentation culture of strain was optimized by Box-Benhnken design and the response surface methodology based on the single factor experiments. The results showed that the fittest carbon source, nitrogen source and inorganic salt were soluble starch, soybean cake and potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) respectively. The regression equation between the production of gellan gum (Y) and the variables from carbon source (x1), nitrogen source (x2) and inorganic salt (x3) by the response surface method were computed. The regression equation was Y=13.87+0.54x1+0.22x2-0.42x3-3.26x12-1.85x22-1.51x32+0.053x1x2+0.067x1x3+0.4x2x3. The optimal culture medium was as follows: 30 g/L soluble starch, 5 g/L soybean cake and 0.7 g/L KH2PO4. The average yield of gellan gum reached to 23.87g/L after fermentation experiment under optimal condition.Key words: Sphingomonas paucimobilis FJAT-5627; Fermentation; Culture medium; Gellan gum; Response surface methodology0前言少动鞘脂单胞菌（Sphingomonas paucimobilis）是结冷胶（Gellan Gum）的发酵生产菌株，其生产的结冷胶具有冷、热条件下形成热可逆凝胶及结构和性质的多样性等优良的性能，在食品、医药和生物制药工业、电泳、固定化细胞和固定化酶等方面具有重要作用1-3。2005年之前，我国的结冷胶市场几乎完全被美国凯可公司垄断，同时高昂的市场价格限制了它在国内的广泛应用4。至今唯有美国实现了结冷胶的工业生产，国内结冷胶生产厂家的生产规模小，生产的结冷胶规格较少，工业化生产中依然存在发酵产率低，发酵过程中通气搅拌能耗高，产物提取繁杂，产品澄清困难等问题，直接导致了生产成本较高，限制了国内结冷胶行业的发展5。在微生物多糖的发酵过程中，选择合适的发酵条件是极其重要的。结冷胶是由少动鞘脂单胞菌在适宜的培养基中经糖代谢合成，少动鞘脂单胞菌发酵培养基组分中，糖类为主的碳源，蛋白质为主的氮源构成发酵原料成本的最大部分。目前，微生物产结冷胶的研究已经有广泛的报道6。其中，氮源的种类和浓度对结冷胶的产量的影响是显著的7，寻找能促进产物合成，又价格低廉的碳、氮源及其配比是实现高产量，低成本生产结冷胶首要解决的问题。以往的研究表明，少动鞘脂单胞菌发酵产生结冷胶至少必须达到20g/L以上才有工业化生产的意义。响应面法（Response Surface Methodology）是建立一个包括各因素的一次项、二次项和任何两因素之间的一级交互作用项的数学模型8, 9，该方法采用可以建立连续变量曲面模型10, 11，对影响生物产量的因子水平及其交互作用进行优化与评价，从而快速有效的确定生物过程的最佳条件，目前该方法现已广泛用于发酵培养基优化、培养条件优化和酶解等生化反应优化和模型建立中12-15。本实验以少动鞘脂假单胞产结冷胶量为目标产物，采用单因素实验和响应面设计对少动鞘脂假单胞最适发酵培养基进行优化，旨为进一步提高结冷胶的产量，为结冷胶工业生产提供理论指导。1材料与方法1.1 材料菌株：少动鞘脂假单胞（Sphingomonas paucimobilis FJAT-5627）。该菌种来源于水稻根系土壤，经MIDI系统和16s RNA鉴定为S. paucimobilis，现保存于福建省农科院农业生物资源研究所微生物菌种保存中心，菌株编号为FJAT-5627。培养基及试剂：葡萄糖、蔗糖、乳糖、玉米淀粉、尿素、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、KH2PO4、MnSO4、CaCl2、MgSO4、乙醇、氢氧化钾。主要设备和仪器：恒温培养箱、摇床、水浴锅、pH计、电子天平、离心机、干燥器、旋转蒸发仪、紫外分光光度计。1.2 方法1.2.1生长曲线测定 按1接菌量，置恒温摇床200rmin振荡培养48h，每隔2h取样分别测定菌种浓度和发酵液中还原糖含量。1.2.2单因子优化设计以结冷胶产量为指标，采用单因子法筛选合适的碳源、氮源、无机盐，确定最适因子，通过梯度试验决定二阶优化范围。具体设计如下：（1）碳源对少动鞘脂单胞菌产胶量的影响。浓度为5 g/L的蛋白胨为氮源，浓度为0.5 g/L的KH2PO4为无机盐，碳源分别选用浓度梯度为10g/L、20g/L、30g/L、40g/L、50g/L的蔗糖、葡萄糖、乳糖和可溶性淀粉，配制发酵培养基1L，pH为6.87.2，121高压20min，瓶装量为250ml中装50ml，接菌量为5%，摇床培养，培养温度为30，转速为200rmp/min，培养时间为72h。（2）氮源对少动鞘脂单胞菌产胶量的影响。浓度为20g/L的蔗糖为碳源，浓度为0.5 g/L的KH2PO4为无机盐，碳氮源源分别选用浓度梯度为3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、9g/L的蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、豆饼粉和尿素，配制发酵培养基1L，pH为6.87.2，121高压20min，瓶装量为250ml中装50ml，接菌量为5%，摇床培养，培养温度为30，转速为200rmp/min，培养时间为72h。（3）无机盐对少动鞘脂单胞菌产胶量的影响。浓度为20 g/L的蔗糖为碳源，浓度为5 g/L的蛋白胨为氮源，无机盐分别选用浓度梯度为0.3/L、0.4g/L、0.5g/L、0.6g/L、0.7g/L的KH2PO4、MnSO4、CaCl2和MgSO4，配制发酵培养基1L，pH为6.87.2，121高压20min，瓶装量为250ml中装50ml，接菌量为5%，摇床培养，培养温度为30，转速为200rmp/min，培养时间为72h。1.2.3响应面优化设计在单因素筛选试验的基础上，根据Box-Benhnken设计原理，采用软件Design expert进行三因素三水平的响应面的分析试验，以结冷胶产量为相应值，确定各因素对少动假单胞菌胞外粗多糖产量影响的显著性和各组分的最佳组合。根据Box-Benhnken设计原理，响应因子Y为少动鞘脂假单胞的产胶量，淀粉(x1)、豆饼粉(x2)和KH2PO4(x3) 为三因素，因素三水平分为：-1、0和1，试验设计具体见表1。表 1 Box-Behnken因素水平表Table1 The table of Box-Behnken factors变量代码编码水平未编码编码-101淀粉x1A20 g/L30 g/L40 g/L豆饼粉x2B4 g/L5 g/L6 g/LKH2PO4x3C0.6 g/L0.7 g/L0.8 g/L1.3 指标测定方法（1）菌株生物量：取5ml菌液，以培养基为空白对照，测定波长为640nm时，样品的吸光值。（2）发酵液中还原糖含量：还原糖含量测定采用DNS方法，量取10ml发酵液，稀释1000倍，5000r/min离心，取上清液，测定波长为540时，样品的吸光值。标准曲线回归方程为：y=0.5748x（R2=0.9932）（3）结冷胶的提取：取发酵液离心后上清液，用约2到3倍体积的95%酒精的沉淀，然后在8000r/min下离心20min，收集沉淀，80下烘干24h称干重，即为粗胞外多糖。1.4 数据处理数据统计分析通过EXCEL数据处理，统计学分析通过DPS软件，数据采用Fishers LSD test方差分析，响应面分析法利用Design-expert 6.0软件采用Box-Benhnken设计方法，对培养基的氮源，碳源，无机盐进行三因素三水平优化。2 结果与分析2.1 菌株的生长曲线少动鞘脂单胞菌生长曲线见图1。该菌生长的适应期为0-2h，对数生长期为2-6h，生长稳定期为6-30h。2-6h时，菌株浓度迅速增加，6-24小时菌种浓度缓慢增加，24小时后，菌体浓度基本维持在2.5左右，而发酵液中还原糖含量在2-6h迅速减少，6h以后发酵液中的还原糖含量基本不变。图 1 少动鞘脂假单胞的生长曲线Fig.1 The growth curve of Sphingomonas paucimobilis FJAT-314612.2 培养基的单因子优化（1）碳源的筛选分别以葡萄糖、蔗糖、乳糖和淀粉为碳源，其他培养条件不变，研究不同碳源对FJAT-5627菌体生长及产胶的影响（表2），结果表明：以葡萄糖或者淀粉为碳源，发酵液中生物量较多，菌体生长较好。葡萄糖浓度为30 g/L、淀粉浓度为40g/L时，菌体生长最好，生物量最高；蔗糖和乳糖产的生物量很少。从FJAT-5627菌产胶能力看，淀粉浓度为40g/L时，产胶量最高，达到25.92 g/L；蔗糖和葡萄糖其次，产胶量分别在2.85-5.69 g/L、1.44-5.71 g/L；乳糖的产胶量最少。表2 不同碳源对少动鞘脂假单胞的生长量和产胶量的影响Table 2 The effects of different carbon source for growth and yield of gellan gum of Sphingomona paucimobilis FJAT-5627碳源10g/L20g/L30g/L40g/L50g/L生物量粗结冷胶生物量粗结冷胶生物量粗结冷胶生物量粗结冷胶生物量粗结冷胶蔗糖0.230.02c2.850.25c0.250.02b3.020.27b0.280.02c3.340.29b0.290.03c3.930.35b0.560.05b5.690.50b葡萄糖2.620.23a5.710.50b1.200.11a3.540.31b1.180.10b3.000.26b1.150.10b2.880.25b0.730.06b1.440.13c乳糖0.390.47c2.990.26c0.330.03b1.690.15b0.180.02c1.220.11b0.330.03c1.660.16b0.300.03c1.520.13c淀粉1.1711.41b14.371.27a1.300.11a14.641.29a2.530.18a20.521.8a2.480.22a25.922.29a1.410.12a11.821.04a注：表中数值为平均值标准误，同一列中不同字母表示在5%水平上差异显著（Fishers LSD test）。Note: Values are meanSE. Different letters in the same column indicate that means are significantly different at P0.05(Fishers LSD test) .（2）氮源的筛选分别以蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、豆饼粉和尿素为氮源，其他发酵条件不变，研究不同氮源对FJAT-5627菌体生长及产胶的影响（表3），结果表明：以牛肉膏、蛋白胨、酵母粉或者豆饼粉为氮源，发酵液中生物量较多，菌体生长较好。牛肉膏浓度为6 g/L、蛋白胨浓度为5 g/L、酵母粉浓度为5g/L、豆饼粉浓度为4g/L时，菌体生长好，分别为3.04 g/L、2.656 g/L、2.913 g/L、2.431 g/L；尿素产的生物量很少。从FJAT-5627菌产胶能力看，豆饼粉浓度为5g/L时，产胶量最高，达到9.02 g/L；牛肉膏和酵母粉其次，最高产胶量分别为4.59 g/L、4.23 g/L；蛋白胨较少，其产胶量为1.96-3.71 g/L；尿素的产胶量最少。表3 不同氮源对少动鞘脂假单胞的生长量和产胶量的影响Table 3 the effects of different nitrogen source for growth and yield of gellan gum of Sphingomonas .paucimobilis FJAT-5627氮源3 g/L4 g/L5g/l6 g/L7 g/L生物量粗结冷胶生物量粗结冷胶生物量粗结冷胶生物量粗结冷胶生物量粗结冷胶蛋白胨0.3810.220c2.240.129b0.7640.044c2.4400.141c2.6560.153ab3.3800.195b2.4580.1423.7200.215bc0.4820.028c1.9600.113c牛肉膏0.3100.018c0.4100.024c2.5430.147a3.5000.202b2.7410.158ab3.5900.207b3.0420.176c4.5900.265b2.6530.153a3.0100.174b酵母粉0.7260.420b2.6100.151b1.3230.076b3.0400.176bc2.9130.168a4.2300.244b2.100.121b3.1900.184c2.6870.155a3.5200.203b豆饼粉2.3970.138a5.2900.305a2.4310.140a9.1800.530a2.3990.139b9.0200.521a2.2590.130b8.4200.486a1.9390.112b4.3700.252a尿素0.0090.001d0.8200.047c0.0100.001d0.5800.034d0.0100.001c0.4200.024c0.0120.001c0.5600.032d0.0150.001d0.5900.034d注：表中数值为平均值标准误，同一列中不同字母表示在5%水平上差异显著（Fishers LSD test）。Note: Values are meanSE. Different letters in the same column indicate that means are significantly different at P0.05(Fishers LSD test) .（3）无机盐的筛选分别以KH2PO4、MnSO4、CaCl2或者MgSO4为无机盐，其他发酵条件不变，研究不同无机盐对FJAT-5627菌生长量和产胶量的影响见表4。结果表明：KH2PO4、CaCl2或者MgSO4均有助于菌株生长。其中MgSO4浓度为0.7g/L时，菌株生长最好，生物量最高达到0.582；CaCl2浓度为0.4g/L和KH2PO4浓度为0.7g/L时，菌株生长较好，生物量可达分别为0.513和0.497；MnSO4的菌株生长不好，生物量很低，说明MnSO4不利于菌株的生长。从产胶量来看，KH2PO4浓度为0.7g/L时，产胶量最高，产胶量为3.63 g/L；MgSO4其次，产量最高可达3.27 g/L，CaCl2次之，产胶量最高可达2.14 g/L，MnSO4的产胶量最少。表4 不同无机盐对少动鞘脂假单胞的生长量和产胶量的影响Table 4 The effects of different inorganic salt for growth and yield of gellan gum of Sphingomonas paucimobilis FJAT-5627无机盐0.3g/L0.4g/L0.5g/L0.6g/L0.7g/L生物量粗结冷胶生物量粗结冷胶生物量粗结冷胶生物量粗结冷胶生物量粗结冷胶KH2PO40.2340.014a2.2500.130b0.2450.014b2.4400.141b0.2590.015b2.6200.151b0.3930.023a2.5500.147a0.4970.029b3.6300.210aMnSO40.0510.003b0.4400.025c0.0650.004c0.5500.032c0.0500.003d0.8600.050d0.0560.003d0.9100.053c0.0600.004c0.6400.037cCaCl20.2680.016a3.7100.214a0.5130.030a2.1000.121b0.1610.009c2.1400.124c0.1120.007c1.2900.075b0.1200.007c1.8500107bMgSO40.2360.014a2.4200.140b0.2990.017b2.9700.172a0.3670.021a3.2700.189a0.2710.016b2.2900.132a0.5820.034a1.6000.092b注：表中数值为平均值标准误，同一列中不同字母表示在5%水平上差异显著（Fishers LSD test）。Note: Values are meanSE. Different letters in the same column indicate that means are significantly different at P0.05(Fishers LSD test) .2.3 培养基响应面法优化（1）培养基响应面法优化试验试验结果见表5。淀粉浓度为20-40g/L，豆饼粉浓度为4-6g/L，KH2PO4 浓度为0.6-0.8g/L，粗结冷胶产量17-25g/L。表5 Box-Benhnken响应面优化试验结果Table 5 Box-Behnken values by Response Surface design标号淀粉g/L豆饼粉g/LKH2PO4 g/L粗结冷胶含量g/L实际值预测值120.004.000.7017.8918.06230.004.000.6021.5619.02330.005.000.7024.3418.39420.005.000.8018.4319.56540.005.000.6019.6419.05630.004.000.8019.2919.99740.004.000.7017.9218.08830.005.000.7020.5919.29930.006.000.8019.2621.111040.006.000.7018.7320.741130.005.000.7023.7919.471230.005.000.7024.2120.711340.005.000.8018.5723.871430.005.000.7024.4223.871520.006.000.7018.4923.871630.006.000.6020.9223.871720.005.000.6019.1723.87（2）二次响应面回归模型的建立利用Design-expert软件对表5实验数据进行二次多项回归拟合，获得少动鞘脂假单胞的产胶量Y对自变量淀粉A（x1）、豆饼粉B（x2）、KH2PO4C（x3）的多元回归方程。回归方程为：Y=13.87+0.54x1+0.22x2-0.42x3-3.26x12-1.85x22-1.51x32+0.053x1x2+0.067x1x3+0.4x2x3相关系数R=0.9613，校正决定系数R2=0.9117。回归方程方差分析见表6，方程的二次项A2、B2和C2 的P值均0.01，表明方程二次项对少动鞘脂假单胞产胶量有极显著影响。而方程的相互项AB和AC的P值均0.05，表明其对少动鞘脂假单胞产胶量的影响是显著的。由方程的显著性分析得F=19.35，相应的概率值P=0.00040.1，失拟不显著，失拟性分析表明，该回归方程无失拟因素存在，回归模型与实测值能较好地拟合。表 6 回归方程的方差分析表Table 6 Analysis of variance for the regression equation项目Sum of Squares自由度Mean SquareF值Prob FSource模型参数80.3898.93019.3500.0004significantA2.2912.2904.9600.0612B0.3810.3800.8200.3954C1.3911.3903.0200.1258A244.71144.71096.850 0.0001B214.47114.47031.3400.0008C29.5819.58020.7600.0026AB0.01110.0110.02400.8816AC0.01810.0180.0390.8482BC0.6510.6501.4000.2748Residual3.2370.460Lack of Fit0.9530.3200.550.6727not significantPure Error2.2840.570Cor Total83.6216（3）响应面和等高线分析Box-Behnken方法的图形是特定的响应面Y对应的因素A、B、C构成的一个三维空间在二维平面上的等高图，可直观反映各因素对响应值的影响，为了更直观的表现2个因素同时对少动鞘脂假单胞的产胶量的影响，可以令其他因素水平值为零, 仅考虑这两个因素对产胶量的影响，即进行降维分析。得到的二元二次方程可以绘出相应的响应面图和等高线图，见下图。图2a显示了KH2PO4位于最佳值，即0.7g/L时，淀粉和豆饼粉对少动鞘脂假单胞产胶量的相互影响效益，由图可直观看出此两营养因素的相互作用较显著。等高线的形状可反映出交互效益的强弱大小，椭圆形表示两因素交互作用显著，而圆形则与之相反16。该响应面开口朝下，少动鞘脂单胞菌产胶量Y随着豆饼和淀粉浓度增大而增大，当Y达到12.9248后，Y值随着豆饼粉和淀粉浓度增大而减少。图 2豆饼粉和淀粉对产胶量影响的响应面立体图（a）和等高线（b）Fig.2. Responsive surface plot(a) and coutours plot (b) of effects of soybean cake and soluble starch on the yield of gellan gum图3a显示了豆饼粉位于最佳值，即5g/L时，KH2PO4和淀粉对少动鞘脂假单胞产胶量的相互影响效益，从图中可以看出，当KH2PO4浓度为0.6-0.7g/L时，产胶量随着浓度的增大而增大，当KH2PO4浓度为0.7g/L时，产胶量有最大值，当KH2PO4浓度为0.7-0.8g/L时，产胶量随浓度的增大而降低；当淀粉浓度为20-30g/L时，产胶量随着浓度的增加而增大，当淀粉浓度为30g/L时，产胶量有最大值，当淀粉浓度为30g/L-40g/L时，产胶量随着浓度的增加而降低。图 3淀粉和KH2PO4对产胶量影响的响应面立体图（a）和等高线（b）Fig.3 Responsive surface plot(a) and coutours plot (b) of effects of soluble starch and KH2PO4 on the yield of gellan gum图4a显示了淀粉位于最佳值，即30g/L时，KH2PO4和淀粉对少动鞘脂假单胞产胶量的相互影响效益，从图中可以看出，当KH2PO4浓度为0.6-0.7g/L时，产胶量随着浓度的增大而增大，当KH2PO4浓度为0.7g/L时，产胶量有最大值，当KH2PO4浓度为0.7-0.8g/L时，产胶量随浓度的增大而降低；当豆饼粉浓度为4-5g/L时，产胶量随着浓度的增加而增大，当豆饼粉浓度为5g/L时，产胶量有最大值，当豆饼粉浓度为5g/L-6g/L时，产胶量随着浓度的增加而降低。图 4豆饼粉和KH2PO4对产胶量影响的响应面立体图（a）和等高线（b）Fig.4 Responsive surface plot(a) and coutours plot (b) of effects of soybean cake and KH2PO4 on the yield of gellan gum（4）优化组合与验证为了得到少动鞘脂假单胞最佳发酵培养基，将所得回归方程分别对各自变量取一阶偏导等于零可得一个三元一次方程：0.54-3.260x1+0.053x2+0.067x3=00.22-1.850x2+0.053x1+0.400x3=0-0.42+0.067x1+0.400x2-1.510x3=0求解方程组，可得模型极值坐标为：x1=0.16，x2=-0.18，x3=0.25相当于淀粉浓度为30 g/L， 豆饼粉浓度为5 g/L，KH2PO4的浓度为0.7 g/L，求得少动鞘脂假单胞产孢量最大预测值为23.87g/L。用上述得到的最优培养基进行验证试验，得到少动鞘脂单胞菌实际产胶量为23.591.25 g/L，与预测值23.87 g/L有良好的拟合性，说明模型具有有效性，此优化结果有效，得到的优化组合为少动鞘脂单胞菌最优培养基。3 结论与讨论结冷胶发酵培养基是一种含有碳源、氮源和无机盐的简单培养物。充足的碳源和少量的氮源有助于细菌胞外多糖的分泌17。碳源的种类和浓度直接影响细菌胞外多糖分泌量和胞外多糖的结构属性等18。Nampoothiri等6和Bajaj等19比较了分别以可溶性淀粉、葡萄糖、乳糖、麦芽糖和蔗糖作为发酵碳源时结冷胶的产量，结果淀粉的结冷胶产量最高，达到24-28g/L，与本研究结果相近。但彭志英和张红城（2000）得到以葡萄糖或蔗糖为碳源，发酵液中生物量较多，菌体生长较好，蔗糖浓度为30g/L，葡萄糖浓度为20-40g/L时，菌体生长最好，生物量最高，乳糖一般，淀粉产的生物量极少，几乎没有增量20。Hyuck et al.21比较了以蛋白胨和豆饼粉为氮源时S.paucimobilis NK2000结冷胶产量，其最大产量分别为3.27 g/L和7.33 g/L。Nampoothiri et al.6比较了以各种有机氮和无机氮为氮源时S. paucimobilis ATCC 31461的结冷胶产量，结果得到最适氮源为蛋白胨。Bajaj et al.19研究得到酵母膏为S. paucimobilis结冷胶高产的最适氮源。无机盐类型在少动假单胞菌株发酵过程中，对发酵液的粘度有重要影响。彭志英等20发现浓度为0.5g/L的KH2PO4产胶量较多，发酵黏度也大；0.1g/L MgSO4或0.3g/L MnSO4的产胶率最高。结冷胶的产胶量与培养基的组分有密切的关系，目前结冷胶的产胶量8.63g/L-27.86g/L22, 基本上都是采用优化培养基的组分来提高结冷胶的产量。响应曲面法是一种优化生物过程的统计学试验设计方法，采用该法可以建立连续变量曲面模型，对影响生物过程的因子及其交互作用进行评价，确定最佳水平范围，而且所需的试验组数相对较少，可节省人力物力，因此该法已被成功应用于各种各样的生物优化过程中。Banik等人通过Plackett-Burman设计得到S. paucimobilis产结冷胶最优组合，这个优化组合为糖蜜112.5 g/L，胰蛋白胨1 g/L，罗蛋白水解物1 g/L，磷酸氢二钠1 g/L，氯化锰0.947g/L23，在此条件下得到结冷胶产量为13.814 g/L。作者通过Box-Behnken响应面设计优化培养基组合下少动鞘脂假单胞FJAT-5627发酵得到结冷胶可达23.87g/L，产量优于Banik23、Hyuck21、彭志红20等人的研究结果，说明该组合具有为结冷胶工业生产提供理论指导的潜力。虽然Arockiasamy等人通过中心合成设计得到结冷胶最高产量为27.86 g/L22，本研究采用响应曲面法优化结果使得少动鞘脂假单胞FJAT-5627发酵得到结冷胶可达23.87g/L，具备了工业生产的意义。大量研究也表明发酵条件及方法对结冷胶的产胶量有很大影响，如高溶氧20，高转速24，生物反应器选择25等。本研究仅考虑了培养基方面的影响，在接下来的试验过程将以此优化组合为基础，通过优化发酵条件，改进发酵工艺进一步提高少动鞘脂单胞菌的产胶量，为结冷胶的工业生产提供技术理论指导。参考文献1 胡国华，黄绍华，陈雷. 明列子饮料悬浮剂的研究和应用J. 中国食品添加剂，2001(5): 54-57.2 李小勇，李洪军，贺志非，等. 结冷胶及其在食品工业中的应用J. 食品与发酵工业，2005， 31(6):94-96.3 李海军，颜震，朱希强，等. 结冷胶的研究进展J. 食品与药品，2005，7(12A):3-8.4 许怀远，任向妍，王垚. 结冷胶凝胶特性及在食品工业中的应用J. 中国食品添加剂， 2009(04): 54-62.5 胡国华. 新型食品胶在我国的开发应用现状及前景J. 中国食品添加剂，2005(C00):33-42.6 Nampoothiri K M，Singhania R R，Sabarinath C，et al. 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