ELISA_直接法与间接法的区别

精品文档ELISA 可用于测定抗原, 也可用于测定抗体. 在这种测定方法中有三个必要的试剂 1) 固相的抗菌素 原或 抗体 , 即 免 疫 吸 附 剂 (immunosorbent);(2) 酶 标记 的 抗原或 抗 体 , 称 为 结合 物 (conjugate);(3) 酶反应的底物 . 根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件, 可设计出各种不类型的检测方法.ELISA 可分类是根据抗原抗体的结合情况来分类的。主要有以下几种类型: (直接法也称一步法)1 双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法, 操作步骤如下:1) 将特异性抗体与固相载体联结, 形成固相抗体. 洗涤除去未结合的抗体及杂质.2) 加受检标本, 保温反应 . 标本中的抗原与固相抗体结合 , 形成固相抗原抗体复合物 . 洗涤除去其他未结合物质.3) 加酶标抗体 , 保温反应 . 固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合. 彻底洗涤未结合的酶标抗体 . 此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关.4) 加底物显色. 固相上的酶催化底物成为有色产物. 通过比色 , 测知标本中抗原的量 . 在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg,HBeAg,AFP,hCG等.只要获得针对受检抗原的异性抗体 , 就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法. 如抗体的来源为抗血清, 包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物 . 如应用单克隆抗体, 一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗 , 分别用于包被固相载体和制备酶结合物 . 这种双位点夹心法具有很高的特异 性 , 而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应, 作一步检测.在一步法测定中 , 当标本中受检抗原的含量很高时, 过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合 , 而不再形成 夹心复合物 . 类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象, 此时反应后显色的吸光值(位于抗原过剩带上)与标准曲线( 位于抗体过剩带上) 某一抗原浓度的吸光值相同 ( 参见 1.3.2, 图 1-4),如按常法测读, 所得结果将低于实际的含量, 这种现象被称为钩状效应 (hook effect), 因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落. 钩状效应严重时 , 反应甚至可不显色而出现假阴性结果. 因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质(例如血清中HBsAg,AFP和尿液hCG等)时，应注意可测范围的最高值. 用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应 .假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇，例如HBsAg的a决定簇，也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物 . 但在 HBsAg 的检测中应注意亚型问题 ,HBsAg 有 adr,adw,ayr,ayw4 个亚型 , 虽然每种亚型均有相同的 a 决定簇的反应性 , 这也是用单抗作夹心法 应注意的问题 .双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子(RF) 的干扰 .RF 是一种自身抗体, 多为 IgM 型 , 能和多种动物IgG的Fc段结合.用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF,它可充当抗原成份同时与固相抗体和酶标抗体结合 , 表现出假阳性反应. 采用 F(ab) 或 Fab 片段作酶结合物的试剂 ,由于去除了 Fc段，从而消除RF的干扰.双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响，已被列为这类 试剂的一项考核指标。 双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原, 但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原 , 因其不能形成两位点夹心.2 双抗原夹心法测抗体 反应模式与双抗体夹心法类似. 用特异性抗原进行包被和制备酶结合物 , 以检测相应的抗体. 与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体 . 此法中受检标本不需稀释, 可直接用于测定 , 因此其敏感度相对高于间接法. 乙肝标志物中抗HBs 的检测常采用本法 . 本法关键在于酶标抗原的制备 , 应根据抗原结构的不同 , 寻找合适的标记方法.3 间接法测抗体间接法是检测抗体常用的方法. 其原理为利用酶标记的抗抗体( 抗人免疫球蛋白抗体 ) 以检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法（见图2-3）.操作步骤如下：1）将特异性抗原与固相载体联结 ，形成固相抗原.洗涤除去未结合的抗原及杂质.2）加稀释的受检血?t，保温反应.血清中的特异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物 .经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体，血清中的其他成份在洗涤过程中被洗去.3）加酶标抗抗体.可用酶标抗人Ig以检测总抗体，但一般多用酶标抗人IgG检测IgG抗体.固相免 疫复合物中的抗体与酶标抗体抗体结合，从而间接地标记上酶.洗涤后，固相载体上的酶量与标本中受检抗体的量正相关.4）加底物显色本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断.间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法.间接法成功的关键在于抗原的纯度虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结果，但应尽可能予以纯化，以提高试验的特异性.特别应注意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质，例如以E.Coli为工程酶的重组抗原，如其中含有E.Coli成份，很可能与受过 E.Coli感染者血甭中的抗E.Coli抗体发生反应.抗原中也不能含有与酶标抗人Ig反应的物质，例如来自人血浆或人体组织的抗原，如不将其中的Ig去除，试验中也发生假阳性反应.另外如抗原中含有无关蛋白，也会因竞争吸附而影响包被效果.间接法中另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性.病人血清中受检的特异性IgG只占总IgG中的一小部分.IgG的吸附性很强，非特异IgG可直接吸附到固相载体上，有时也可吸 附到包被抗原的表面.因此在间接法中，抗原包被后一般用无关蛋白质（例如牛血清蛋白）再包被一次，以封闭（blocking）固相上的空余间隙.另外，在检测过程中标本须先行稀释（1:401:200）,以避免过高的阴性本底影响结果的判断酶标抗体制备技术百科名片酶标抗体制备技术基本要求是将酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合既不改变抗体的免疫反应活性， 也不影响酶的生物化学活性。用于标记抗体的酶较多， 常用的有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化物酶和3半乳糖甘酶等。目录辣根过氧化物酶标抗体制备技术过氧化物酶McAb-PAPJ 备技术碱性磷酸酶标抗体制备技术碱性磷酸酶展开辣根过氧化物酶标抗体制备技术过氧化物酶McAb-PAI备技术碱性磷酸酶标抗体制备技术碱性磷酸酶展开则三辣根过氧化物酶标抗体制备技术辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase , HRP广泛分布于植物中，因辣根中含量 最高而得名，由无色酶蛋白和深棕色铁吓咻（辅基）构成一种糖蛋白（含糖18%。此酶溶于水和50%包和度以下的硫酸钱溶液。HRP分子量较小（40kDa）,标记物容易穿透入细胞内部；作用底物为 H2O2以二氨基 联苯胺（DAB为供氢体的反应产物为不溶性的棕色吩嗪衍生物，可用普通光镜观察；在 pH3.512范围内稳定，对热及有机溶剂的作用亦较稳定，能耐受63 c加热15min；用甲苯与石腊包埋切片处理或用纯乙醇及10好醛水溶液固定作冰切片均不影响其活性；溶解性好，100mL缓冲盐溶液中可溶解 5gHRP并可溶解于62%饱和度以下的硫酸钱溶液中，故常 用硫酸钱分级沉淀法分离纯化；氧化物、硫化物、氟化物、及叠氮化物等对 HRP勺活性有抑制作用，应避免使用 NaN3作为酶标试剂的防腐剂，以防止失活。凡能在HR林口 H2O2存在时被酶催化 H2O板应而和成有色产物的化合物（供氢体）都 可以用显色剂。供氢体的产物分不溶性和可溶性两类。前者最常用的为3, 3二氨基联苯胺（3,3 diaminobenzidine,DAB）,适用于免疫组化法；反应后的氧化型中间体迅速聚合，形成 不溶性棕色吩嗪衍生物；这种多聚物还能还原和螯合四氧化饿，形成具有电子密度的产物， 适用电镜检查；此外还有饱和联苯胺溶液，氧化后产物呈黄褐色， 多用于酶免疫扩散的深沉线显色。后者最常用的为邻苯二胺（O-phenylene diamine,OPD）,产物橙色，可溶性、敏感性高，最大吸收值为490nm，可用肉眼判别；易被浓酸终止反应，颜色可数小时不变，是ELISA 中最常用的一种；但对光敏感，使用时要避光，并发现有致癌作用。用HRPfe记抗体需借助交联剂的作用，将酶连接在抗体分子上。常用的交联剂为过碘 酸钠和戊二醛（glutaraldehyde,CHO-（CH2）3-CHO）。改良过碘酸钠法HRP分子中与酶活性无关的糖基被过碘酸钠氧化为醛基，再与抗体蛋白的氨基形成 schiff碱。为了防止酶蛋白的氨基与醛基反应发生自身偶联，在标记前先用2, 4-二硝基氟苯（DNFB封闭酶蛋白中残存的“-和卜氨基。酶与抗体的结合反应后，再加入硼氢化钠（NaHB4）还原成稳定的结合物。标记步骤（1）取5mg HRP于0.5mL蒸储水，加入1%2，4而二硝基氟苯（DNFB无水乙醇溶 液0.1mL,室温（20 C 土）下轻微搅拌作用 1h。（2）加入1mL 0.06mol/L NaIO4 ,室温下避光轻搅 30min,溶液呈黄绿色。（3）加入1mL0.16mol/L乙二醇，室温（20 c当下轻搅作用1 h ,终止氧化反应。（4）加入5mg抗体（Ig ）,装入透析袋，置 0.05mol/L , pH9.6碳酸盐缓冲液（无水 碳酸钠1.5g,碳酸氢钠2.93g,蒸储水加至1 000 mL） 1 000 mL中，4c透析过夜，更换 3 次。（5）取出透析袋中液体（约 3 mL）,加入 5mg/mLNaHB4 0.2 mL 4 C 2h或过夜。(6)力口 50%包和硫酸俊(NH4 2SO4溶液(硫酸俊 850g,蒸储水加至1 000 mL以30% 氨水调pH7.2) 6 mL沉淀结合物，置 4 c 30min后，3 000r/min 离心30min ,取深沉(SPA 不需要进行此步)。(7)将沉淀物溶于PBS(0.02M pH7.4)中，装入透析袋，并以此缓冲液透析平衡 6-12h , 换1夜3次。(8)在结合物内加入 BSA至蛋白浓度为10mg/ mL,或加等量60%T油，测定工作效价 后，小量分装(或冻干，不需加甘油)，低温保存备用。戊二醛交联法戊二醛是一种常用的同型双功能交联剂，通过它的两个醛基分别与HR可口抗体蛋白的氨基结合，形成 HRP我二醛-Ab蛋白结合物。反应可在 4-40 C温度范围，pH6.08.0的缓 冲溶液中进行，分为一步法和二步法，戊二醛一步法是将酶和待标记抗体混合，同时加入戊二醛进行交联反应。戊二醛二步法是将酶先与戊二醛作用，形成酶-戊二醛结合物，结过透析或层析除去未结合的戊二醛，然后再与抗体结合。标记步骤(1)取 10mgHR的于 0.2 mL1.25% 戊二醛(用 0.01mol/L、pH6.8PB 将 25峨二醛稀释 为1.25%),室温(20c左右)反应结合 18h。(2)用0.15mol/LNaCl平衡过的Sephadex G-50凝胶柱洗脱，除去游离的戊二醛，或 用 0.01mol/L , pH7.2PBS, 4 c透析过夜。(3)将5mg抗体IgG溶于1mL0.15mol/L NaCl ,再与醛化 HR崎液(10mg/mL)混合。(4)加入0.1mL1mol/L pH9.6 碳酸盐缓冲液(调节 pH至9.09.6) , 4C,电磁搅 拌下结合24h。(5)加入0.1mL0.2mol/L赖氨酸(0.29g溶于10mL蒸储水)，4c放置2h,以封闭残 留的醛基，终止反应。(6)装入透析袋，以 0.01mol/L、pH7.2 PBS, 4c透析过夜，或通过 Sephadex G-200 凝胶柱层析，用 PBS洗脱，U攵集第1峰洗脱液，加入等量 60%T油，测工作效价后，小量分简介抗过氧化物复合物制备技术Stemberger(1970)等，首先报道了过氧化物酶 -抗过氧化物酶复合物(peroxidase-antiperoxidase,PAP )法，止匕法也称为斗 标 t己抗体酶法(unlabelled antibodyenzymemethod) 。 PA所不需用任何化学交联剂处理酶和抗体，二者活性不受化学反应的影 响，可大大提高免疫酶法的灵敏度。标记步骤(1)取 5mL抗 HRPffl!清,16 000r/min 4 C离心 20min ,取上清液。(2)力口入 1mL HRP(2mg/mL瞪液混匀，室温(20c 土)静置 1h, 16 000r/min , 4c离 心20min ,取沉淀物。(3)加冷生理盐水反复洗涤 -离心(16 000r/min , 4c离心20min) 3次，弃上清，取 沉淀物。(4)加入过量 HRP夜4mL (2mg/mD混匀后，移至小烧杯内。(5)在pH计监控下，边搅拌边加入0.1及0.01mol/L HCl调至pH2.4左右，使沉淀完全溶解。(6)立即加入 0.01mol/LnaOH,调 pH7.4, 16 000r/min , 4 c离心 20min ,取上清液。(7)加入1/10体积的0.075mol/L醋酸钠和0.15mol/L醋酸俊的等量混合液后混匀。(8)电磁搅拌下逐滴加入等量饱和硫酸钱溶液，并继续搅拌10min, 4 c放置20min,16 000r/min , 4c离心20min,去上清，取深沉物。(9)以50%包和硫酸钱洗涤，4C、16 000r/min X20min ,离心2次，取深沉物。(10)加5mL蒸储水将深沉物溶解后装入透析袋，用 Ph6.75醋酸盐缓冲液(13.5L生 理盐水、1.5L蒸储水、75mL 1.5mol/L 醋酸钠及75mL粉酶3moL/L醋酸俊)4c透析3d,每 天换液2次。(11) 17 000r/min , 4c离心20min ,取上清液进行工作效价鉴定。(12)加等量60%t油，小量分装，-20 C保存。编辑本段McAb-PAPfe!备技术用抗HRP McA闹备PAP复合物的工艺条件较为简便，而且不需严格的条件限制。用小 鼠抗HRPMcAb制备的腹水，按一定的HRP/IgG克分子比混和，置 37c水浴反应2h,即成鼠PAP复合物。以按 HRP/IgG克分子比为4： 1制备为宜。编辑本段碱性磷酸酶标抗体制备技术简介碱性磷酸酶(alkaline phosphatase , AP),系小牛肠粘膜和大肠杆菌中提炼出来的一种磷酸酯的水解酶，由多个同功酶组成。从小牛肠粘膜提取的AP分子量为100kDa,酶作用的最适pH为9.6;从大肠杆菌中提取酶分子量为80kDa,最适pH为8.0。它的作用底物较多，常用的酶底物有对硝基本磷酸盐( PNP、伊甘油磷酸钠、磷酸泰酯等。AP主要用作双标记染色，研究递质共存及酶免疫测定。AP标记抗体，一般采用戊二醛作交联剂一步法，使酶和抗体蛋白的氨基分别与戊二醛的两个醛基结合。标记步骤(1)取抗体(25mg/mD 1mL加入 AP 5mg溶解。(2)装入透析袋，用 0.01mol/L、Ph7.2PBS4c透析18h,换液3次。(3)力口入 2.5%戊二醛 20uL,室温(20c 土)放置 2h。4c0.01mol/L、pH7.2PBS透析 过夜，换液3次。(4)移入0.05mol/L、pH8.0Tris-HCl缓冲液中，4c透析过夜，换液 3次。（5）取出标记抗体，用含 BS序口 0.02%NaN3的Tris-HCl缓冲液稀释至 4mL即为酶 标记物原液。（6）加入1/3量纯甘油，测定工作效价后，小量（0.1mL）分装，4c保存（使用前以pH7.4PBS-吐温溶液将结合物适当稀释）。编辑本段碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶复合物制备技术Mason等（ 1978）,用碱性磷酸酶代替过氧化物酶，建立了碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶复合物（APAAP桥联酶标技术。但以AP作为抗原用常规免疫方法制备的抗血清，很难达到 APAPPW联酶标技术的质量要求，在一定程度上限制了此项技术的推广使用。杨志刚等（1989）利用抗AP的McAb建立了一种制备 APAAPM合物的简便方法。只需将AP和抗AP的McAb以适当比例混合，4c结合过夜即可使用。采用改良的ELISA方法检测APAAPT合中 AP的最适含量。具体方法是：用羊抗鼠Ig包被微量滴定板；加入一定量的抗APMcAb分别加入不同量的AP作用后经过洗涤；加底物显色，测定光密度值（OD。在一定范围内，APAAP 复合物溶液中AP含量增加的同时，相应的OD直也随之增大；当AP增加到一定量时（约6 8mg/mD、OD1保持稳定。7欢在下载欢迎您的下载,资料仅供套考!致力为企业和个人提供合同协议， 策划案计划书，学习资料等等打造全网一站式需求