细胞冻存的方法与步骤

精品文档细胞冻存、解冻方法与细胞计数江苏大学附属医院风湿科李晶返回主页一、细胞冷冻保存1. 材料：生长良好之培养细胞、新鲜培养基、DMSO(Sigma D-2650) 、无菌塑料冷冻保存管(Nalgene5000-0020) 、 0.4 （ w/v ）trypan blue(GibcoBRL15250-061)、血球计数盘与盖玻片、等速降温机(KRYO10SeriesII)2、冷冻保存方法：（ 1）传统方法 :冷存管置于410 分钟 ->-2030 分钟 ->-8016 18 小时 ( 或隔夜 )->液氮槽 vaporphase长期储存。- 20不可超过1 小时，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入- 80冰箱中，惟存活率稍微降低一些。（ 2）程序降温：利用已设定程序的等速降温机 以 -1 - 3/ 分钟之速度由室温降至（- 80以下） - 120，再放在液氮槽vaporphase 长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma 之保存。3、步骤：（ 1）冷冻前24-48 小时更换半量或全量培养基，使细胞处于指数生长期。（ 2）配制冷冻保存溶液( 使用前配制 ) ：另取一离心管，加入培养基、血清，逐滴加入二甲基亚砜（DMSO）至 20%浓度，即制成双倍的冻存液，置于室温下待用。（ 3）离心收集培养之细胞，用加血清的培养基重悬起细胞，取少量细胞悬浮液( 约 0.1ml) 计数细胞浓度及冻前存活率。（ 4）取与细胞悬液等量的冻存液，缓慢逐滴加入细胞悬液，并晃动试管，制成细胞冻存悬液（DMSO最后浓度为5 10），使细胞浓度为15×10 6cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1 2ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。严密封口后，注明细胞名称、代数、日期。然后进行冻存。4、注意事项：（ 1）欲冷冻保存之细胞应在生长良好 (logphase) 且存活率高之状态，约为 8090致密度。冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如 hybridoma 应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。.精品文档（ 2）细胞在液氮中可长期冻存无限时间，而不会影响细胞活力；在-70 度可保存数月。（ 3）注意冷冻保护剂之品质。DMSO应为试剂级等级，无菌且无色 ( 以 0.22micronFGLPTelflon过滤或是直接购买无菌产品，如Sigma D-2650) ，以 510ml 小体积分装， 4避光保存，勿作多次解冻。Glycerol亦应为试剂级等级 ，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。本方法中先制备双倍冻存液，可避免DMSO直接加入时释放的热量对细胞的损伤。缓慢逐滴加入细胞悬液是使细胞逐步适应高渗，可降低细胞受损。 DMSO可能引起部分白血病细胞株的分化，可换用10%甘油冻存。（ 4）冷冻保存之细胞浓度：normal human fibroblast:13×10 6cells/mlhybridoma:1 3×10 6cells/ml，细胞浓度不要太高，某些hybridoma 会因冷冻浓度太高而在解冻24 小时后死去。6adherenttumor lines:57×10，依细胞种类而异。Adenocarcinoma 解冻后须较高之浓度，而HeLa 只需 163×10 cells/mlother suspensions:510×106cells/ml，human lymphocyte须至少 5×106cells/ml。（ 5）冷冻保护剂浓度为5 或 10 DMSO，若是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个backupculture，以防止冷冻失败。（ 6）冻存可用10% 90%的血清，一般高浓度血清有助于维护细胞活力，此处介绍20%终浓度有利于细胞悬浮而少沉积（ 4 度时），复苏存活率在80% 90%以上，对原代培养细胞，以90%血清冻存更为有效。二、冷冻细胞活化1、冷冻细胞之活化原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞之死亡。2、细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常( 例如产生单株抗体或是其它蛋白质)。3、材料37恒温水槽、新鲜培养基、无菌吸管/ 离心管 / 培养瓶、液氮或干冰容器4、步骤：（ 1）操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害。（ 2）自液氮或干冰容器中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。（ 3）将新鲜培养基置于 37水槽中回温，回温后喷以70%酒精并擦拭之，移入无菌操作台内。（ 4）取出冷冻管，立即放入37水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化，以70%酒精擦拭保存.精品文档管外部，移入无菌操作台内。（ 5）取出解冻之细胞悬浮液，缓缓加入有培养基之培养容器内( 稀释比例为1:10 1:15) ，混合均匀，放入CO2培养箱培养。取0.1ml 解冻细胞悬浮液作存活测试。（ 6）解冻后是否立即去除冷冻保护剂( 例如 DMSO或 glycerol)，依细胞种类而异，一般而言，大都不需要立即去除冷冻保护剂。惟若要立即去除，则将解冻之细胞悬浮液加入含有5-10ml 培养基之离心管内，离心1000rpm，5 分钟，移去上清液，加入新鲜培养基，混合均匀，放入CO2培养箱培养。（ 7）若不需立即去除冷冻保存剂，则在解冻培养后隔日更换培养基。三、细胞计数与存活测试1、原理：（ 1）计算细胞数目可用血球计数盘或是Coultercounter粒子计数器自动计数。（ 2）血球计数盘一般有二个2chambers，每个 chamber 中细刻 9 个 1mm大正方形，其中 4 个角落之正方形再细刻16 个小格，深度均为 0.1mm。当 chamber 上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为2-4ml。使用1mm×0.1mm=1.0x10时， 计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每 ml 中之细胞数目。（ 3）存活测试之步骤为 dyeexclusion，利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。 一般使用蓝色之trypan blue 染料， 如果细胞不易吸收 trypan blue ，则用红色之 Erythrosinbluish 。计算细胞活率：活细胞数 / （活细胞数 +死细胞数）× 100%。计数应在台盼兰染色后数分钟内完成，随时间延长，部分活细胞也开始摄取染料；因为台盼兰对蛋白质有很强的亲和力，用不含血清的稀释液，可以使染色计数更为准确。2、材料：0.4%w/v trypan blue(GibcoBRL15250-061)； Erythosin bluish stain；取 0.1gram Erythrosinbluish(SigmaE-9259)及 0.05gram preservative methyl paraben(SigmaH-3647)溶于 100mlCa+/Mg+freesaline；血球计数盘及盖玻片(Hemocytometerandcoverslip)；计数器 (counter)；低倍倒立显微镜；粒子计数器(Coultercounter,CoulterElectronics)。白细胞稀释液（4%乙酸溶液）。3、步骤：（ 1）取 50 l 细胞悬浮液与50l trypan blue(orErythrosinbluish)等体积混合均匀于1.5ml 小离心管中。（ 2）取少许混合液( 约 15l) 自血球计数盘chamber 上方凹槽加入，盖上盖玻片，于100 倍倒立显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色( 或红色 -Erythrosin bluish)。（ 3）计数四个大方格之细胞总数，再除4，乘以稀释倍数( 至少乘以2，因与 trypanblue等体积混合 ) ，最后乘以 104，即为每ml 中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线上，只计上线与右线之细胞( 或计下线与左线之细胞) 。注： 4 大格细胞总数×稀释倍数×10 4/4= 细胞数 /ml ；每一大格的体积 =0.1cm×0.1cm×0.01cm=10-4 ml.精品文档计数板计数时，最适浓度为510×10 5 细胞 /ml ，此范围外计数误差偏大。高浓度细胞悬液，可取出部分作稀释或连续稀释后计数。5、范例：T75 monolayer culture制成 10ml 细胞悬浮液，取0.1ml 溶液与 0.1ml trypan blue混合均匀于试管中，取少许混合液加入血球计数盘，计数四大方格内之细胞数目。活细胞数 / 方格： 55， 62， 49， 59；死细胞数 / 方格： 5， 3， 4， 6；细胞总数 =243平均细胞数 / 方格 =60.75 ；稀释倍数 =2；细胞数 /ml ：60.75 ×10 4×2（稀释倍数） =1.22 ×10 6；细胞数 /flask（10ml ）： 1.22 ×10 6×10ml=12.2 ×10 6存活率： 225/243 92.6%.