微生物学实验：实验五（二）土壤中微生物的分离纯化及观察

实验五实验五土壤中微生物的分离土壤中微生物的分离纯化与活菌计数纯化与活菌计数 目的要求目的要求1.掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术。物的基本操作技术。2.观察并识别微生物的菌落特征（群体形态）观察并识别微生物的菌落特征（群体形态）。（一）微生物的分离纯化及观察（一）微生物的分离纯化及观察基本原理基本原理 从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。 1. 1.简易单细胞挑取法简易单细胞挑取法 （简易单孢子分离法）（简易单孢子分离法）2.2.平板分离法平板分离法 选择适宜的培养基选择适宜的培养基，微生物在，微生物在固体培养基固体培养基上上生长形成的单个生长形成的单个菌落菌落可以是由一个或几个细胞繁可以是由一个或几个细胞繁殖而成的集合体。殖而成的集合体。 挑取单菌落可获得一种纯培养。挑取单菌落可获得一种纯培养。方法：方法：稀释涂布平板法稀释涂布平板法、平板划线分离法平板划线分离法器材器材分离源：分离源：自采集土壤样品自采集土壤样品培养基培养基 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，高氏牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，高氏号号培养基、马丁氏（孟加拉红）培养基培养基、马丁氏（孟加拉红）培养基溶液或试剂溶液或试剂 盛盛4.5ml4.5ml无菌水的试管，盛无菌水的试管，盛90ml90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶。无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶。仪器或其他用具仪器或其他用具 振荡器，无菌培养皿，无菌振荡器，无菌培养皿，无菌吸管，接种环，电磁炉，培养箱，吸耳球等。吸管，接种环，电磁炉，培养箱，吸耳球等。1 1、编号编号：取无菌平皿个：取无菌平皿个。另取无菌水支，依。另取无菌水支，依次标明次标明1010-2-2、10103 3、1010-4-4、1010-5-5。2 2、倒平板倒平板：分别将三种培养基：分别将三种培养基溶化后，溶化后，冷却至冷却至55556060时时，每种培养基，每种培养基各倒皿各倒皿，标注培养基，标注培养基名称。其中，高氏名称。其中，高氏号培养基在倒入前需先添加号培养基在倒入前需先添加滴滴10%10%的苯酚。的苯酚。一、稀释涂布平板法（全组完成）一、稀释涂布平板法（全组完成）3、制备土壤稀释液 0.5ml各4.5ml 无菌水各取稀释样0.ml涂布放菌液时吸管尖不要碰到液面，即放菌液时吸管尖不要碰到液面，即每一支吸管只接触一个稀释度。每一支吸管只接触一个稀释度。牛肉膏平板牛肉膏平板马丁氏平板马丁氏平板 102 10-3 10-4 10-510-1 10-2 10-3 10-4 10-5 0.5ml 0.5ml 0.5ml高氏高氏号平板号平板、涂布涂布、培养培养 将高氏将高氏号平板、马丁氏平板号平板、马丁氏平板倒倒置置于于28 28 培养培养d d，牛肉膏蛋白胨平，牛肉膏蛋白胨平板板倒置倒置于于37 37 培养培养培养培养1 12d 2d 。、菌落观察、菌落观察观察并描述土壤样品中分离到的细菌、放线观察并描述土壤样品中分离到的细菌、放线菌、霉菌的菌、霉菌的菌落特征菌落特征。、挑菌落挑菌落 将培养出的单菌落进行将培养出的单菌落进行斜面接种斜面接种，并分别置并分别置3737和和2828温室中培养，此后镜温室中培养，此后镜检是否为单一微生物。若有杂菌，继续分检是否为单一微生物。若有杂菌，继续分离纯化。离纯化。二、平板划线分离法（个人完成）二、平板划线分离法（个人完成）1 1、倒平板：倒平板：将种培养基溶化后，各倒一皿。并用记将种培养基溶化后，各倒一皿。并用记号笔号笔标标明培养基名称、样品编号、个人学号等。明培养基名称、样品编号、个人学号等。2 2、划线：划线：分别挑取土壤样品中分别挑取土壤样品中10101 1的土壤悬液一环，的土壤悬液一环，在三种平板上划线，以分离细菌、放线菌、霉菌。在三种平板上划线，以分离细菌、放线菌、霉菌。 分区划线、连续划线分区划线、连续划线分区划线分区划线（适用于浓度较（适用于浓度较大的样品）大的样品）连续划线（适用于浓度较连续划线（适用于浓度较小的样品）小的样品）3、培养培养将高氏将高氏号平板、马丁氏平板倒置于号平板、马丁氏平板倒置于28 28 培养培养d d，牛肉膏蛋白胨平板倒置于，牛肉膏蛋白胨平板倒置于37 37 培培养培养养培养1 12d 2d 。4 4、菌落观察菌落观察、挑菌挑菌 挑取单个菌落接种到斜面上培养，此后镜挑取单个菌落接种到斜面上培养，此后镜检是否为单一微生物。若有杂菌，继续分离纯化。检是否为单一微生物。若有杂菌，继续分离纯化。实验结果实验结果(P4 五、五、.(、)你所做的涂布平板法和划线法是否较好地得到了单菌你所做的涂布平板法和划线法是否较好地得到了单菌落？如果不是，请分析其原因。落？如果不是，请分析其原因。在不同的平板上你分离得到了哪些类群的微生物？简在不同的平板上你分离得到了哪些类群的微生物？简述它们的菌落特征述它们的菌落特征。思考题思考题如何确定平板上某个单菌落是否为纯培养？请写出实如何确定平板上某个单菌落是否为纯培养？请写出实验的主要步骤。验的主要步骤。(P(P4 4 五五.2.(1).2.(1)如果一项科学研究内容需从自然界中筛选到能产高温如果一项科学研究内容需从自然界中筛选到能产高温蛋白酶的菌株，你将如何完成？请写出简明的实验方蛋白酶的菌株，你将如何完成？请写出简明的实验方案。案。(二二)、平板菌落计数法、平板菌落计数法目的要求目的要求学习平板菌落计数的基本原理和方法。学习平板菌落计数的基本原理和方法。基本原理基本原理通过将样品制成均匀的一系列不同稀释度的稀释液，使通过将样品制成均匀的一系列不同稀释度的稀释液，使样品中的微生物细胞充分分散，成单个细胞存在，再取样品中的微生物细胞充分分散，成单个细胞存在，再取一定量的稀释液接种，使其均匀分布于培养皿中特定的一定量的稀释液接种，使其均匀分布于培养皿中特定的选择性培养基内。选择性培养基内。统计数量时，根据统计数量时，根据稀释倍数稀释倍数与与取样量取样量、平板上长出的菌平板上长出的菌落数落数计算出每克或每毫升样品中的微生物数（计算出每克或每毫升样品中的微生物数（CFUCFU）。）。实验器材实验器材菌种：大肠杆菌菌悬液菌种：大肠杆菌菌悬液培养基：牛肉膏蛋白胨培养基培养基：牛肉膏蛋白胨培养基仪器或其他用具：仪器或其他用具：1mL1mL无菌吸管，无菌平皿，盛有无菌吸管，无菌平皿，盛有4.5mL4.5mL无菌水的试管等。无菌水的试管等。两种计数方法两种计数方法倾注法倾注法（本次实验）（本次实验）涂布法涂布法操作步骤（全组完成）操作步骤（全组完成）1. 1.编号编号：取无菌平皿：取无菌平皿9 9个，分别表明个，分别表明10104 4、1010-5-5、1010-6-6（稀（稀释度）各释度）各三套三套。另取无菌水。另取无菌水6 6支，依次标明支，依次标明10101 1、1010-2-2、10103 3、1010-4-4、1010-5-5、 1010-6-6。七支无菌吸管也依次编号。七支无菌吸管也依次编号。10-4 10-5 10-6原样 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-60.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.2ml0.2ml0.2ml2.2.稀释稀释: :3.取样取样0.5ml4.倒平板倒平板：倒入融化后冷却至倒入融化后冷却至4545的培养基的培养基1515mlml，置水平位置迅速旋动平皿，使培养基与菌液混合均匀。置水平位置迅速旋动平皿，使培养基与菌液混合均匀。5. .培养培养：3737倒置培养倒置培养48h48h。 .计数计数：选择每个平板上长有：选择每个平板上长有3030030300个菌落数的个菌落数的稀释度计算样品含菌量。稀释度计算样品含菌量。实验结果实验结果 P34P34表格表格依据实验结果，分析本次数据是否可靠。依据实验结果，分析本次数据是否可靠。计算每毫升大肠杆菌菌悬液的含菌量。计算每毫升大肠杆菌菌悬液的含菌量。思考题（思考题（ P P3434（3 3）（）（5 5）（）（6 6）（）（）为什么熔化后的培养基要冷却至为什么熔化后的培养基要冷却至4545左右才能倒平板？左右才能倒平板？要使平板菌落计数准确，需要掌握哪几个关键？为什要使平板菌落计数准确，需要掌握哪几个关键？为什么？么？当你的平板上长出的菌落不是均匀分散的而是集中在当你的平板上长出的菌落不是均匀分散的而是集中在一起时，你认为问题出在哪里？一起时，你认为问题出在哪里？用倾注法和涂布法计数，其平板上长出的菌落有何不用倾注法和涂布法计数，其平板上长出的菌落有何不同？为什么要培养较长时间（同？为什么要培养较长时间（48h48h）后观察结果？）后观察结果？倾注法倾注法涂布法涂布法倒平板倒平板a a 皿加法皿加法 b b手持法手持法细细 菌菌放线菌放线菌霉菌霉菌