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成都市第二人民医院检验科 细菌SOP文件编号：CDEY-LAB-XJ-CZ版本/修订号：B/0主题内容微生物标准化操作规程生效日期：20120101第 1 页 共207 页Laboratory of Chengdu No.2 Peoples Hospital成都市第二人民医院检验科 细菌SOP文件编号：CDEY-LAB-XJ-CZ01版本/修订号：B/0主题内容临床微生物标本采集程序生效日期：20120101第 7 页 共207 页Laboratory of Chengdu No.2 Peoples Hospital临床微生物标本采集程序1.目的：规范规范临床标本的采集，减少实验室前的差错影响因素，避免医疗缺陷发生。2.范围：为协助临床诊断和治疗而进行的临床微生物标本的采集。包括血液，骨髓，下呼吸道标本，尿，粪便，化脓和创伤标本，穿刺液，生殖道标本，烧伤标本，。3.职责：指导临床科室正确采集标本，提高实验室的准确性。4.采集程序4.1 血 骨髓4.1.1 送检指征4.1.1.1 症状指征：发热、皮疹、肝脾肿大、关节疼痛、神志昏迷或休克。4.1.1.2 疾病指征：化脓性病灶或损害、黏膜损伤性疾病、肝脏疾病、糖尿病、血液疾病及恶性肿瘤、爱滋病、呼吸道感染或呼吸衰竭、长期输液或导管介入疾病、血液透析患者。4.1.2 标本采集时间： 一般情况下应在病人发热初期或发热高峰时采集。原则上应选择在抗菌药物应用之前，对已用药而因病情不允许停药的患者，也应在下次用药前采集。4.1.3 采集部位何采集的频率4.1.3.1 急性败血症 在24小时内抽血3次或更多次，并可在不同部位，如左、右手臂或颈部。4.1.3.2 急性心内膜炎、治疗前1-2小时内，在三个不同部位采集血样本。4.1.3.3 亚急性心内膜炎 第一天在身体不同部位取三次标本。如果24小时血培养结果阴性，应继续加抽3份血样或更多次，多部位采样送检。4.1.3.4 无名热 应不定期多次、多部位采样送检。24小时内不超过3次，如培养阴性应继续采样送检。4.1.4 标本采集的量 成人采血量8-10ML婴幼儿采血量2-5ML骨髓采集量1-2ML4.1.5 送检采血后立即送检，切勿放冰箱存放4.1.6 结果报告 有迹象细菌生长者，立即图片，染色镜检，结果用电话报告临床。将可疑生长的培养瓶转种于血平板及巧克力平版生长后鉴定报告。若7天仍无细菌生长，报告无菌生长。临床诊断为亚急性心内膜炎者可继续培养2周再出阴性报告。4.1.7 临床意义 正常人血液及骨髓内是无菌的。现代临床医学的发展，广谱、超广谱抗生素的广泛使用，使耐药株增加，院内感染率上升，血液培养中分离出各种微生物种类显著增多，以前认为致病、条件致病或非致病菌的界限现在已不再如此绝对区分。因为任何一种机会致病菌均可能成为败血症的病原菌。其鉴别可依据：1，培养结果2次以上为同一细菌者；2，患者于检出细菌23周后，血液中相应抗体滴度上升，均可视为败血症的病原菌。4.2 下呼吸道标本 送检指征4.2.1 症状指征：咳嗽、咯血、呼吸困难、发热。4.2.2 疾病指征：白喉、百日咳、猩红热、肺炎、肺结核、肺脓肿。4.2.3 标本采集时间：以清晨留取标本为好。留取前最好用清水漱口三次.痰由患者用力咳出.纤维支气管镜检查者可同时抽取分泌物.昏迷患者可作气管穿刺吸取.所有标本最好在应用抗菌药物之前采集标本。4.2.4 采集方法自然咳痰法、支气管镜采集法、胃内采痰法、气管穿刺法、小儿取痰法4.2.5 上呼吸道标本 采集上呼吸道标本通常采用无菌棉拭子。采集前患者应用清水反复漱口，由检查者将舌头向外拉，使腭垂尽可能向外牵引，将棉拭子通过舌根到咽后壁或腭垂的后侧，涂抹数次，但拭子药避免接触口腔和舌粘膜。4.2.6 检验方法 直接涂片法4.2.6.1 痰标本挑取阳性（脓性或血）部分制备2张涂片，一张做革兰染色，另一张根据需要做其他染色。革兰染色后用低倍镜观察白细胞和上皮细胞数量的多少来初步判定。如白细胞10，上皮细胞10，上皮细胞10CFU/ML4.4 粪便 送检指征4.4.1 症状指征：腹泻、高热惊厥。4.4.2 疾病指征：侵袭性病原引起的腹泻 1）细菌性痢疾 2）肠炎 3）肠结核。肠毒素性病原引起的腹泻、抗菌药物相关性腹泻。4.4.3 标本采集：腹泻病人应在急性期采集，以提高检出率，亦最好在用药之前。沙门氏菌感染肠热症在2周以后，胃肠炎病人在急性期，早期采集新鲜粪便,应采集粪便异常部分。最好在抗菌药物应用以前留取。4.4.4 采集方法 自然排便采集法 、直肠拭子方法4.4.5 检验方法4.4.5.1 直接涂片检查 霍乱弧菌涂片检查染色法，涂片用甲醇或乙醇固定革兰氏染色镜检观察革兰氏阴性，呈鱼群样排列杆状或弧形菌。悬滴（压滴）检查，检查细菌动力，霍乱弧菌古典生物型和生物型均呈川梭状运动在悬滴涂片中加入群霍乱弧菌诊断血清后，在显微镜下观察。若原运动活泼的现象停止，为制动试验阳性。可初步报告为疑似群霍乱弧菌。并申报上级卫生机构做出处理。4.4.5.2 培养检查将大便接种于中国兰或麦康凯及SS培养基经35CO，18-24小时，挑取可疑不发酵乳糖菌落接种三糖铁和尿素动力定基质根据其生化反应结果选择适宜的血清学分型霍乱弧菌。1克大便直接接种于硷性蛋白胨水中于35CO 6-8小时转种4号琼脂平板挑取生长菌落进行进一步监定。4.4.6 临床意义 肠道病原菌能引起人类感染性腹泻，亦能由细菌的代谢产物而造成食物中毒，亦能由于长期应用抗菌药物而导致菌群紊乱所致严重腹泻，因此，应及早做出诊断以免延误治疗。 4.5 化脓和创伤标本 送检指征4.5.1 症状指征：局部症状 如红、肿、热、痛和功能障碍时化脓性感染的五个典型症状。全身症状 轻重不一，感染轻微的可无全身症状，感染重的常有发热、头痛、全身不适、乏力、食欲减退等。4.5.2 疾病指征：软组织的急性化脓性炎症、化脓性疾病、脓肿、创伤感染。4.5.3 标本采集：开放性感染和已溃破的化脓灶：标本采集前先用灭菌生理盐水冲洗表面 污染，用灭菌拭子采取脓液及病灶深部的分泌物。封闭性脓肿 通常采用引流术采集。如为慢性感染可抽取感染坏死组织于健康组织之间的少许组织作为培养标本.4.5.4 检验方法：4.5.4.1 直接涂片检查：取洁净玻片将标本均匀涂成薄膜，自然干燥，经火焰固定革兰染色镜检，根据细菌的染色特点、形态、排列作出初步报告“找到革兰阴性或阳性球或杆菌呈*排列”。如发现具有芽孢或荚膜的细菌，报告时应注明芽孢的大小位置：如镜检发现细菌可初步报告“未找到细菌”；对疑有分枝杆菌感染时，标本应作抗酸染色；疑是白喉感染时，标本除作革兰染色，还应作异染颗粒染色。4.5.4.2 细菌培养：取脓汁棉拭子或脓汁接种于血平板上划线分离，置370C培养18-24小时，观察结果，如有菌落生长，根据涂片染色特点和菌落特征初步判断细菌的类属，然后再按其生物学特性进行鉴定。4.5.5 临床意义： 所有创伤均可有细菌污染，但不一定发生感染，细菌学检查对局部细菌的控制是有价值的。同时对导致伤口感染、脓肿形成的病原学诊断有重要意义。确定常居菌是否为创伤感染的病原菌时，要注意该菌是否在数量上占优势。目前看细菌向活组织深部侵入程度及细菌每克组织含细菌量是否达到一定阈值。一般认为每克组织内细菌数量在105-106 个以上时，即可造成伤口感染。4.6 穿刺液 送检指征4.6.1 脑脊液4.6.1.1 症状指征：在成人一般表现为发热、头痛、恶心、呕吐、颈强直和反射增强，婴儿和新生儿临床表现经常不明确和无特异性，对婴儿不明原因的发热，应怀疑为脑膜炎，应采集脑脊液即使送检。4.6.1.2 疾病指征：细菌性脑膜炎拭一组病情较严重的急性感染性疾病。本病可由多种致病菌引起。4.6.2 胸腹水 送检指征4.6 .2.1 症状指征：临床症状多伴由胸痛和发热，腹部出现局限性腹胀及揉面感，胸腔积液有混浊、乳糜性、血性或脓性，腹水成人多于肝硬化腹水者。4.6.2.2 疾病指征：结核性胸膜炎、细菌性肺炎引起的胸膜炎、真菌、原发性腹膜炎、续发性急性腹膜炎。4.6.2.3 采集：怀疑为脑膜炎的病人，应立即采集脑脊液，最好在使用药物之前采集标本。胸腹水 怀疑感染存在，应尽早采集标本，一般在患者使用抗菌药物之前或停用后1-2天采集。4.7 生殖道标本 送检指征4.7.1 症状指征：全身症状：发热、乏力、食欲不振。皮肤黏膜损害。男性泌尿生殖道系统表现：尿痛、尿频、尿急、尿道分泌物增多、性功能障碍等。 性生殖系统表现：阴道分泌物增多及性状异常、月经失调、阴道出血等。4.7.2 疾病指征：前庭大腺脓肿、外阴阴道念珠菌病、细菌性阴道病、急性子宫颈炎、急性盆腔炎、急性尿道炎、急性膀胱炎、羊膜腔感染、产褥气感染。4.7.3 标本采集：清洗尿道口，用灭菌纱布或棉球擦拭，采取脓形分泌物。4.8 烧伤标本 送检指征4.8.1 症状指征：烧伤伴有细菌感染或出现败血症等。4.8.2 疾病指征：烧伤创面脓毒症。烧伤病发症：如肺部感染、静脉炎、烧伤败血症、肠原性感染等。4.8.3 采集：烧伤面愈合前，都可能发生侵袭性感染，通常在早期、深度烧伤溶痂和3度焦痂分离期、后期采集标本。用无菌棉拭子，直接从烧伤创面的脓汁多部位采集，发生败血症应同时做血培养。5. 注意事项 当某些标本的留取出现困难和问题时,请临床科室和实验室密切配合,及时处理。为确保病原微生物的检出率,应尽量减少中间环节.采集好的标本应立即送检,争取在10-20分钟内送到实验室,否则有些微生物会死亡而影响检出。6.参考文献 张秀珍主编当代细菌检验与临床人民卫生出版社成都市第二人民医院检验科 细菌SOP文件编号：CDEY-LAB-XJ -CZ02版本/修订号：B/0主题内容 微生物标本接收处理生效日期：20120101 第 10 页 共207 页Laboratory of Chengdu No.2 Peoples Hospital微生物标本接收处理接种前标本接收处理：1: 核对 接到标本后,检查化验单填写和标本是否一致,和标本是否合格.若标本不合格,退回临床并及时通知临床,然后记录退回标本的病人姓名,科室以及原因.(具体见2)2：标本拒收 出现以下情况，工作人员可根据具体判断拒收标本。2.1 申请单无检查项目或检查项目不清楚的标本，非本实验室检测项目的标本。2.2 姓名明显变更，或出现多个姓名，无法确认标本正确归属的。2.3 申请单和标本分离，标本容器上又无明确患者信息标识的。2.4 空管、标本量过少（标本量见临床微生物标本采集程序）的标本。2.5收集容器不正确；使用非无菌管留取培养标本，用普通大便盒留取培养标本等。正确收集容器见临床微生物标本采集程序。2.6 检标本类别不符，如申请单注明血，但送检标本为胸水。2.7 标本外部有严重的遗洒、渗漏，怀疑标本可能交叉污染的，化验单严重污染，无法填写报告的。2.8 经询问确认标本保存、运输方式不正确的，具体保存方式见临床微生物标本采集程序。2.9审核报告时发现标本超过有效检测时间或污染的，也应视为不合格标本，按拒收标本处理，不能发出报告。3: 拒收处理 3.1对不合格标本应在化验单上注明拒收原因及处理建议,及时发回。3.2如为门诊或急诊患者标本，应由服务台人员或值班人员尽快告知送标本者。3.3如为病房急诊或常规标本，当时发现的应及时退给护理员；经核查后发现的应在2h内给病房打电话，并填写不合格标本电话通知记录表，且于当日将标注清楚的化验单发回病房；对于无法及时报告的不合格门诊标本，应当天将标注清楚的化验单反给病案室或化验单查询处。3.4 将不合格化验单中患者信息和拒收原因填写不合格标本电话通知记录表，以备查询。3.5 对于审核报告时发现与临床严重不符或临床根本不可能出现的结果，而怀疑标本超过有效检测时间或污染的情况，应及时与临床电话联系，并填写不合格标本电话通知记录表。3.6 对于同一病人多次因相同原因拒收标本的，应及时与主管医生联系，了解原因提出建议。 4：标本接种 合格标本写上接收日期和时间,并登记,记帐.然后接种.4.1接种的方法以及分类.点燃酒精灯,右手持接种工具,在火焰上烧灼灭菌.左手持标本管或原代培养物的平皿,试管等.用接种工具挑取适量标本或细菌,痰液挑取脓块,避开口水;痢疾粪便挑取脓血部分.原代培养物挑取单个菌落,液体中取菌,只需在培养液蘸取一满环即可.按培养目的分区划线或区域涂布的方法接种.接种到液体中时,将挑出的菌落在试管有液体的管壁中研磨,细菌即可转入液体中.做穿刺接种时,可垂直刺入高层琼脂中,并沿原位退出,注意不要穿刺到管底.接种后,把接种工具于火焰上烧灼后,放回原处.4.1.1 血培养：以无菌手法真空采血，采血量为510ml ，放35孵育5天后连续划线盲种一次。4.1.2 脑脊液：连续划线接种于血平板及巧克力平板放于CO2 10%环境18-48小时后取出生长细菌染色。根据革兰氏染色的形态进行细菌鉴定。4.1.3痰及上呼吸道标本的检测：接种于巧克力平板、血平板、麦康凯培养基,并四区画线分别放入35孵箱18-24小时后观察菌落特征。4.1.4尿标本的检测：连续划线接种于血平板及麦康凯培养基，放孵育小时。4.1.5分泌物、化脓性感染标本 分区划线接种于血平板及麦康凯培养基，放 孵箱小时。4.1.6胸腹水、穿刺液 连续划线接种于血平板及麦康凯培养基，放孵箱小时。4.1.7大便标本：腹泻 、高热标本如怀疑霍乱弧菌用碱性蛋白胨水培养6-8小时,连续划线接种于4号琼脂孵育18-24小时。常规用分区划线接种于麦康凯培养基35度生长18-24小时5: 接种后标本处理 5.1 标本接种后的微生物标本放入贴有生物危险2级的污物桶内,血培养标本接种后放置7天转种血平板,已转种的培养瓶放入贴有生物危险2级的污物桶内. 贴有生物危险2级的污物桶用高压灭菌.5.2 抗酸杆菌标本放入用清洁的玻璃瓶留取后放入贴有生物危险2级的铁盒高压灭菌后涂片镜检.5.3 吸取菌液的滴管用后放入装有含氯2克/升的消毒液中冲洗后高压灭菌后使用 6：工作总结及临床沟通：6.1定期(一般一个季度)向临床科室报告从临床各种标本分离的细菌种类以及对抗菌药物的敏感性结果.供临床医生初步选择抗菌药物参考.6.2 分段报告微生物培养结果,以便临床医生及时用药.6.2.1实验室工作人员接到标本后,按要求进行涂片和接种。.不符合质量要求的标本,应及时与临床科室联系并重新留取标本.6.2.2 需要涂片的标本立即涂片染色，并尽快电话报告临床科室，正式报告于第二个工作日出具。 6.2.3在三个工作日内，对接种的标本进行鉴定并做抗菌药物敏感性试验,并出具书面报告。特殊疑难菌种及时向临床电话报告，书面报告依鉴定程序顺延。6.2.4 需要保存的标准菌株和各种质控细菌按培养要求进行培养或保存。6.2.5做好报告回访工作,了解实验室诊断结果和临床诊断的符合情况,从而找出存在的问题,以备改进工作。7：紧急情况的处理 如遇到烈性传染性病原菌或严重院内感染和其他需要上报的菌种，需要立即与临床联系和上报保健科，并填写医院紧急情况处理登记册。 成都市第二人民医院检验科 细菌SOP文件编号：CDEY-LAB-XJ -CZ03版本/修订号：B/0主题内容基本染色方法生效日期：20120101 第 13 页 共207 页Laboratory of Chengdu No.2 Peoples Hospital基本染色方法1.染色准备：染色的第一步是制作涂片。菌液涂片时，用接种环沾取菌液点在载玻片上，标本可直接在玻片上涂布。菌落涂片时，先取生理盐水 1滴，置玻片上，用接种针挑取菌落，在盐水中涂布。涂片时必须注意应轻轻操作。猛烈的动作会改变菌细胞原有的排列形式，或造成细菌鞭毛脱落，影响结果的准确性。制备的涂片应自然干燥，并经火焰固定，固定温度不宜过高，以玻片背面接触手背不烫为准，否则可能使细胞形态改变。将固定后的涂片进行染色。2.几种基本染色方法2.1 革兰染色本染色是最基本的染色法，可用于标本涂片或菌落涂片。染色结果将细菌分为革兰阳性(紫色)和革兰阴性(红色)两类。2.1.1 结晶紫溶液 A液：结晶紫2g 95乙醇20ml B液：草酸铵 0.8g 蒸馏水 80ml 需在用前24h将A液、B液混合，过滤后装入试剂瓶内备用。2.1.2 碘液碘 1g碘化钾 2g蒸馏水 300ml碘与碘化钾混合并研磨，加入几毫升水，使其逐渐溶解，然后研磨，继续加入少量蒸馏水至完全溶解。最后补足水量。也可用少量蒸馏水，先将碘化钾完全溶解，再加入碘片，待完全溶解后，加水至300ml。2.1.3 脱色液：95乙醇。2.1.4 复染液 A. 贮存液：沙黄2.5g 95乙醇100ml B. 应用液：A液 10ml蒸馏水 90ml2.1.5 染色方法：A涂片经火焰固定，加结晶紫液染30s，清水冲去染液。 B加碘液染30s，水洗。 C加脱色液，不时摇动约510s，至无紫色脱落为止，水洗。 D加复染液，染30s，水洗。 E干后镜检。3、抗酸染色抗酸染色直接用于痰标本时，可以适当增加标本涂片的厚度，以提高检出率。染厚涂片时，须掌握复染色时间。如果背景过深，影响镜检。奴卡菌及放线菌可呈弱抗酸性，取培养菌落涂片染色时，呈现两种现象，视野中有些菌细胞阳性，另外一些则阴性；有时同一个菌体上，红色的深浅亦有不同，观察时应予注意。抗酸染色有两种常用方法： 碱性复红法又称萋纳(ZiehlNeelsen)法(我们使用的方法)。 荧光染料金胺O法(也称金胺O-罗丹明B法)。碱性复红染色法3.1 试 剂3.1.1 萋纳石炭酸复红溶液 碱性复红乙醇饱和溶液10ml 5石炭酸溶液 90ml3.1.2 脱色剂 * 浓盐酸 3ml 95乙醇97ml3.1.3 复染液(吕弗勒美蓝液)美蓝乙醇饱和溶液30ml10氢氧化钾0.1ml蒸馏水 100ml3.2、染色方法3.2.1 涂片经火焰固定，加石炭酸复红溶液，徐徐加热至有蒸汽出现，切不可沸腾。染5 min(若染色奴卡菌需要加长时间)，水洗。3.2.2 加脱色剂，不时摇动玻片至无红色脱落为止，水洗。3.2.3 加复染液，染0.5l min，水洗。3.2.4 干后镜检。分枝杆菌呈红色，背景为蓝色。3.2.5 奴卡菌、放线菌标本染色时，脱色剂改用2硫酸水溶液。4、墨汁荚膜染色用于观察菌体有无荚膜结构，借此鉴定某些菌，如新型隐球菌。传统的方法是用印度墨汁，但目前国内无售。常规工作可以用墨汁或墨水代替，但应注意颗粒不能太粗，否则影响观察结果。有人用5黑色素(nigrosin)水溶液做染料，效果较好。4.1、试 剂印度墨汁或5黑色素水溶液。4.2、染色方法将标本与1滴染色液在载玻片上混合，加上盖玻片，轻轻压一下，使标本混合液变薄。在低倍镜下寻找有荚膜的菌细胞。找到后，转换高倍镜确认。 成都市第二人民医院检验科 细菌SOP文件编号：CDEY-LAB-XJ -CZ04版本/修订号：B/0主题内容 HF151UV二氧化碳孵箱操作程序及维护生效日期：20120101 第 16 页 共207 页Laboratory of Chengdu No.2 Peoples HospitalHF151UV二氧化碳孵箱操作程序及维护1.目的：某些细菌（如脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、牛布鲁菌等）在510的CO2环境中生长较好，比在一般情况下生长速度较快，为了更及时准确地检测出致病菌，为临床提供治疗诊断的依据。2.原理：本仪器是通过人为地调节仪器内部的CO2达到一定浓度，造就一个适合上述细菌生长的厌氧环境，使细菌生长速度加快，缩短TAT。3.工作条件：环境温度：1830 相对湿度：80%周围无强烈震动及腐蚀性气体存；无阳光直接照射及其他冷热源的影响。4.操作步骤：4.1 仪器出厂设置： 温度37.0， CO2.04.2 打开玻璃门，向水池中注入蒸馏水（约4L），关门。4.3 将超温控制器旋钮调至39。4.4 将仪器的通气接口连接于CO2气源。4.5 将仪器后壁开关调于OFF位置。4.6 将仪器接通电源，开机。开机后仪器将自动执行常规检测功能，此时CO2及温度均显示【888】。约40秒后，常规检测完毕，CO2及温度均显示腔内实际值。4.7 如果需要进行紫外清洁功能，需进行如下操作：4.7.1 在确保仪器内无培养物后，打开仪器后壁紫外清洁保护开关，将CO2设定为.0。4.7.2 按【】键不放，同时按住【】键或【】键，使“”显示窗显示【222】，放开【】,再连续按一下【】，【CO2】窗口显示【0】，此时，便进入了特殊功能“222”（紫外灯开关），按【】【】，设定CO2显示窗为【1】，并按【】键确认，紫外灯开关被打开，紫外灯点亮，【CO2】窗口显示【-】，并闪烁。4.7.3 内腔中紫外灯点亮时，注意勿直视灯管！4.7.4 约30分钟后，清洁过程结束，内腔紫外灯熄灭，显示板显示实际值。打开玻璃门，使腔内臭氧散出，关闭仪器后壁紫外灯保护开关。（如果不需要进行清洁功能，只需按照第7步进行操作。）4.7.5 同时按下【】键和【】键约10秒钟，直至“CO2”窗口显示【0.0】AUTO-START灯亮，放开两键。仪器将启动AUTO-START功能。4.7.6 等待约16至24小时，此时仪器温度将显示37.00.1，CO2将显示00.1CO2，一手按住【】键，一手使用【】键或【】键将温度显示窗内值置为3，放开两键，再按一下【】键，然后按一下【】，此时CO2显示窗内值将显示【.0】。4.8 将CO2气源出口压力调至1bar（0.1MPa）。4.9 一手按住【CO2】键，另一支手使用【】键或【】键输入CO2设置（例如7.0或5.0），仪器将自动通气直至达到CO2设定值。此时的仪器方可进行培养工作。4.10 器工作结束后，必须按照“步骤10”将CO2设置值置为【.0】，然后再关机，打开玻璃门使腔内气体散去，并擦干内胆腔体。5、仪器的维护：5.1 基本维护：5.1.1 每日维护：每天必须用清洁的柔软抹布擦拭仪器的外表面，使仪器的外表面保持清洁。5.1.2 周维护：5.1.2.1 检查蓄水池的水位：每周必须检查蓄水池的水位，如果蓄水池的水位太低容易引起整个培养器中的湿度明显下降这样容易导致细菌生长受到影响，使培养结果出现误差。因此必须按期检查水位。5.1.2.2 检查气源输入压力是否正确：因为一般的细菌生长多在6.0的CO2浓度的情况下生长较好，否则细菌生长会受到抑制，出现假阴性。气源压力必须调节到1bar。5.1.3 每六周需要的维护：5.1.3.1 消毒并清洁内腔：首先要关掉仪器，然后打开玻璃门，使用电动虹吸泵把水池中的水全部抽取出来，然后使用浸泡了消毒水的抹布对对内腔进行消毒清洁，最后再用消过毒的干抹布擦干水份。5.1.3.2 紫外消毒：在上述的消毒清洁内腔后，进行紫外消毒。具体方法见操作步骤第七步。5.1.3.3 做一次AUTO-START，具体做法操作步骤第八九步。5.2、报警的维护：当仪器的某些参数超过了设定的参数值，那么蜂鸣器就会发出警报，提示错误此时你只需要按着【i】键，在显示器上就会出现相应的故障代码。当故障出现时，故障的代码，可能导致的原因及采取的措施见下表：故障代码可能原因措施99玻璃门开着门未关关门100温度过低（设置点）温度极限控制器设置过低，查看指示灯检查温度极限控制器调节101温度过高（设置点）环境温度过高关闭门加热开关，或使用缓慢加热方式200CO2过低（设置点）CO2未接通CO2钢瓶用尽CO2入口压力过低接通气源更换CO2钢瓶调节入口压力：1bar201CO2过高（设置点）CO2入口压力过高调节入口压力：1bar故障发生时并不是所有的故障都能显示，有些故障不能显示，如果遇到可能的原因及处理办法见下表：故障检查方法仪器不加热检查设置值仪器不进气察看发光二极管GAS的情况检查是否进气被关闭检查设置值故障产生时蜂鸣器未报警检查蜂鸣器是否处于开的状态。不能改变设置值设置点被锁定。玻璃门上有大量的蒸馏水检查功能5门加热开关是否开启。根据上述的方法不能排除故障，请与工程师联系。然后关主机电源开关，并关闭气源减压阀。每次维护时或故障维修时必须把相关情况填写在仪器维护记录表上，以便查询。6、注意事项：6.1 仪器必须安装在有足够通风的房间内运转。6.2 安装表面必须是固定、水平以及不可燃烧的。6.3 仪器的使用调节及维护必须是经过相关培训的或责任管理人员进行。 成都市第二人民医院检验科 细菌SOP文件编号：CDEY-LAB-XJ-CZ05版本/修订号：B/0主题内容 HFsafe生物安全柜操作规程及维护生效日期：20120101 第 20 页 共207 页Laboratory of Chengdu No.2 Peoples HospitalHFsafe生物安全柜操作规程及维护1.目的：为了满足生物安全操作的要求，并且达到在操作时保护操作人员的目的，使细菌操作达到无菌操作的要求，便于操作的标准化。2.原理：通过使用空气超高过滤器（ULPA）的过滤，使仪器内部的空气洁净度达到100级，使细菌的一般操作限制在一个相对密闭的环境中，不但保护操作人员，还可满足操作的标准化。3.工作条件：环境温度：1830 相对湿度：、总开关：位于控制面板的右侧，是设备的总控制开关。2、FAN键：用于开/关风机。3、LAMP键：用于开/关照明光源。4、UV键：用于开/关紫外光源。5、MUTE键：用于关闭报警的蜂鸣器，建议在问题解决前不要关闭蜂鸣器。6、COUNTER：用于显示该设备操作运行时间（以小时计算）。7、N.PRESSURE：用于显示负压腔中的相对气流负压状态和低压预警提示。8、门锁按钮：位于面板的左侧，用于锁住前玻璃门于关闭位置，放置非操作人员打开前玻璃门。 成都市第二人民医院检验科 细菌SOP文件编号：CDEY-LAB-XJ-CZ06版本/修订号：B/0主题内容实验室高压蒸气灭菌器操作程序生效日期：20120101 第 22 页 共207 页Laboratory of Chengdu No.2 Peoples Hospital实验室高压蒸气灭菌器操作程序1目的：1.1 培养基等的液体灭菌，溶解。1.2 器具等的灭菌。1.3 废弃物的处理灭菌。2原理：高压蒸气灭菌。灭菌温度105-135，溶解温度60-100，保温温度45-60；压力0-0.235兆帕3工作条件:环境温度:5-35背面距离墙10厘米以上,右侧距离墙5厘米以上。需放置在无阳光直接照射及湿度不高,灰尘少的地方。4.操作步骤：放置排气储存桶 注意:不得在灭菌器附近放置或放入可燃性物质,爆炸性物质,氧化性物质,易燃性物质,可燃性气体。在排气容器孔中务必插入排气软管添密件,关紧盖罩,接通电源开关注意:安装专用电源连接插口,安装地线,可靠接地。发生异常情况时立即停止运转,切断电源。 检修时要切断电源。打开盖子注入加热用水 注意: 需采用蒸馏水或自来水。放入灭菌物品注意: 不得将灭菌物品装入蒸气不能进入的容器和袋子,否则无法灭菌; 装盛灭菌物品的容器不得密封。不要让灭菌物品堵塞和挤压灭菌器内的孔和温度传感器。仅对试管,烧瓶等容器本身灭菌时,开口要向下或横放。物品灭菌时，应同时放入监控指标。用对热敏感的染料标记的变色带子。灭菌时，将变色带夹放在试验包裹中, 以监视灭菌效果，关闭盖子选择过程(变更设定内容)(设定预定运行作业)注意: 运行中要开启排水阀。按下操作按钮 R1或b1 C1 D1灭菌 . 保温 灭菌.溶解 器具灭菌运行 注意:运行中如有蒸气泄漏时，不要靠近安全阀排气口。 运行完毕, 打开盖子,取出灭菌物品注意:不要被烫伤,脸不要靠近灭菌器。切断电源开关排放加热用水 成都市第二人民医院检验科 细菌SOP文件编号：CDEY-LAB-XJ -CZ07版本/修订号：B/0主题内容 BD BACTEC 9120 血培养仪生效日期：20120101 第 27 页 共207 页Laboratory of Chengdu No.2 Peoples HospitalBD BACTEC 9120 血培养仪1.原理及目的 培养瓶内的各种营养物质可提供微生物生长的物质基础,而微生物生长过程中的代谢产物之一CO2将激活瓶内底部荧光感应物质,而发出荧光,荧光信号变化与CO2变化成正比. BD BACTEC 9120血培养仪每10min探头对培养瓶扫描一次，连续监测系统自动地查出微生物的生长，并发出多种信号通知操作人员。菌血症是临床医学急症，引起菌血症的细菌通常是多重耐药菌，尽早采集血培养和进行准确的抗生素敏感试验对危重患者感染的诊断，治疗和预后有重要的临床意义。2.范围血液标本和脑脊髓液，关节液，胸腹腔积液等无菌部位的标本。3.职责临床医生负责按正确的操作方法取病人血标本并注入血培养瓶；细菌室人员负责标本的接受、审核、登记编号、上机，阳性标本的传种、鉴定、药敏以及菌株的保存，正式报告的发出。4.标本的种类及收集方法BD BACTEC 9120血培养仪可检测血液，脑脊髓液，关节液，胸腹腔积液等无菌部位的标本。每个血培养瓶注入无菌抽取的规定量的静脉血。为防止皮肤寄生菌污染培养瓶，采集静脉血前要用消毒剂（碘酊或碘复）对皮肤进行仔细充分的消毒处理，以便将污染减少到最低程度。标本采集后立刻送到实验室, 在不得已的情况下，可短期内（12h）置于室温，不要冷藏。采集血培养瓶数量和采血时间：1 可疑急性原发性菌血症或真菌血症, 脑膜炎，骨髓炎，关节炎或肺炎，依据临床情况立即取血作23份血培养。不明原因的发热（例如：深部脓肿，伤寒热，波浪热）首次取血作23份血培养， 2436 h后, 估计温度快要升高之前，立即再取血作23份血培养 (通常在下午)。可疑感染性心内膜炎, 在头12 h内，取血作3份血培养，如果24h后3份结果均阴性，再取血作3份血培养。入院前2周内接受抗生素治疗的患者，3天内连续取血作血培养，每天2份。5.仪器及试剂BD公司BACTEC 9120全自动监测系统，该仪器使用的培养基种类见下表，有效期内可室温贮藏。中文名称采血量培养基体积适用标本标准厌氧瓶3-10ml25ml来源于未使用过抗生素患者的标本树脂需氧瓶3-10ml25ml来源于已使用过抗生素患者的标本树脂厌氧瓶3-10ml40ml来源于已使用过抗生素患者的标本树脂儿童瓶1-3ml40ml儿童或其他采血困难的标本含溶血素厌氧/真菌瓶3-10ml40ml需溶血的厌氧菌,真菌培养含溶血素分枝杆菌/真菌瓶3-10ml40ml来源于无菌体液的分枝杆菌,真菌标本6.操作步骤6.1 血培养瓶接收标准6.1.1 检查培养瓶确保安全地放置。6.1.2 用肉眼观查微生物生长的可视信号，注意血液层上面是否有絮状沉淀、均匀的或表面下的混浊、溶血、液体培养基凝固、有一层表面薄膜、产生气体、血层表面或 深层有白色颗粒等。6.1.3 检查瓶子上的标签，与申请单上的患者资料是否一致。6.1.4 瓶内血液量必需够量，也不能超量，并在报告单上注明血液量。6.2 不合格血培养标本的处理6.2.1 拒收培养瓶：血培养瓶标识与化验申请单不符，培养瓶破裂或明显污染。处理方法：立即与临床医师联系，报告拒收的具体理由。6.2.2 补做培养瓶：血标本采集后放置12h以上（手工法除外），用不适当类型的培养瓶收集标本，用过期的培养瓶收集标本，采血量不足等。 处理方法：立即与临床医师联系，报告标本不合格的具体理由，建议补做血培养。6.3 血培养操作6.3.1 采集标本后的血培养瓶立即上机监测，孵育温度设为35C。扫描条型码，录入患者的姓名，年龄，性别，病历号，专科，采集时间，上机时间，标本类型。6.3.2 仪器报警及红灯闪烁的血培养瓶可能为阳性瓶；绿灯闪亮的为阴性瓶。立即用注射器无菌法抽取阳性瓶中培养物作涂片、革兰染色、显微镜检查。同时接种麦康凯琼脂平皿, 血琼脂平皿, 必要时增加厌氧血平皿或巧克力琼脂平皿。依据显微镜检查结果，一方面向临床报告细菌形态及染色特性。另一方面可作初步的、非标准抗生素敏感试验。6.3.3 戴乳胶手套，在生物安全柜或防止传染的操净台内操作。6.4结果报告6.4.1 阳性结果两级报告制当日报告：阳性血培养结果非常重要，应该立即口头报告给临床医生，包括：革兰染色特征和形态，和其它的鉴定信息（如革兰阳性球菌疑似为葡萄球菌等）。报告之前，应该回顾一下患者近期送检标本中微生物培养情况，这些结果有助于解释感染微生物的来源。同时记录报告的日期，时间，内容以及接受报告人的姓名。最终报告 细菌培养鉴定后, 最终向临床正式报告细菌种或属和标准抗生素敏感试验结果。6.4.2 阴性结果报告：普通血培养3天无细菌生长可报告为：“72小时培养未见细菌生长”，但培养瓶要继续培养至7天，如果发现有菌生长，可发补充报告。怀疑有真菌或其它慢生长菌，应延长至1430天。6.5 质量控制6.5.1 全自动的血培养系统的孵箱、机器进样孔或分析组件应按照厂商的规定标准进行检测，所有维护、保养程序应定期进行。6.5.2 培养瓶QC :BD建议对每批培养瓶均做阳性与阴性质控，质控方法请参照培养瓶随附说明。6.5.3 对进样孔用标准棒作质控检测，不能通过时立即进行校正程序。6.5.4 仪器兼有培养箱的作用，每日记录其温度。7BACTEC9120血培养仪操作流程7.信息输入7.1. 培养准备完毕后：注意临床送检的 培养瓶标本是否已将瓶上的 双条码之一，贴于检验单上 。7.1. 按F3Culture,在出现的Culture界面上输入信息。7.1. 计算机自动制定培养瓶放置胡的位子。7.1. 按F10 存盘。7. 上机（Vial Entry）培养瓶信息输入电脑后：7.2. 打开主机门7.2. 用条码扫描仪扫条码面板“Vial Entry”7.2. 扫描瓶上条码，孵育架上瓶位指示灯亮7.2. 将培养瓶放入指定瓶位7.2. 听到的的的三声指示操作结束，关门。注意：请勿在检测时（软件界面孵育架显示L或T）开门，否则将丢失一次检测数据。7.、 取出阴性瓶（Remove Negative）主机对普通细菌培养的默认培养周期为5天，5天内如检测不到细菌生长，将作为阴性瓶处理，软件界面“Summary”与瓶位编号指示阴性瓶出现。7.3.1 打开主机门7.3.2 用条码扫描仪扫描条码面板“Remove Negative”,阴性瓶所在位置瓶位指示灯亮7.3.3 逐个取出阴性瓶。如仪器设定为“逐个取出阴性瓶”的用户，在阴性瓶取出后需逐个扫描瓶上条码：如仪器设定为“成批取出阴性瓶”的用户，无需再扫描瓶上条码7.3.4 听到的的的的三声指示操作结束，关门7. 取出阳性瓶（Remove Positive）主机检测到阳性瓶后，软件界面“Summary”，瓶位编号以及主机外部“Psoitive Vial”均会给出阳性指示，并伴有报警声。7.4.1 按F2消除报警声7.4.2 打开主机门7.4.3 扫描条码面板“Remove Positive”，阳性瓶所在位置瓶位指示灯亮7.4.4 逐个取出阳性瓶，并同时扫描瓶上条码7.4.5 听到的的的三声指示操作结束，关门。7. 重新放回功能（Re-Enter）对于阳性瓶，如在仪器设置中设置了重新放回功能“Re-Entry”,则仪器保留该瓶位以及相关数据三小时，等待重新输入，重新输入时操作同培养瓶上机操作。注意：如果三小时内不将该培养瓶重新放回，则所有数据不再保留。7. 匿名瓶问题（Anonymous）见P167. 错误瓶位与错误瓶（Error）见P17注意：当系统同时存在匿名瓶和错误瓶时，务必先解决匿名瓶。8.参考值正常人血培养应为阴性，即血瓶中无菌生长。9.临床意义血培养阳性对患者的诊断和预后有重要的意义。血培养阳性的原因有多种：当细菌或真菌在血液中迅速繁殖，超出网状内皮系统清除能力，而且引流或抗感染治疗失败，就会产生持续菌血症，并感染血管外组织，也可能病原微生物经淋巴管进入血液，入血流；或患者发生血管内感染，例如：感染性心内膜炎，真菌性动脉瘤，化脓性静脉炎，感染性动脉瘘和动静脉导管炎。对入院的重症患者，采血培养应该在系统性抗生素治疗之前，病人发热（38C）或低温（36C），但白细胞增多（计数大于10109/L，特别是出现核左移未成熟的或杆状核），粒细胞减少（成熟的多核白细胞小于1109/L）或上述几种情况并存时进行。在评估可疑新生儿败血症中，除发热或低烧外，很少培养出细菌, 常要加补做尿和脑脊液的培养。小儿，特别是2岁或2岁以下幼儿，患肺炎球菌与流感嗜血杆菌菌血症，伴明显发热（39.4C）和白细胞增多（总数
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