原核表达步骤

实验方法与步骤1 表达质粒的构建及测序分析1.1 cofilin-1的片段的准备1.1.1 引物设计根据在GenBank上查找人源cofilin-1的基因序列，用Primer Premier 5.0软件进行上下游引物的设计，并送往上海生物工程技术服务有限公司合成的PCR引物。引物如下：引物名称序列F-cofilin-15-AAGTCGACATATGGCCTCCGGTGTG-3R-cofilin-15-TCTCTCGAGGGCTCACAAAGGCTTG-3将以上引物用灭菌的三蒸水稀释成10mol/L，分装于Eppendorf管中，-20冰箱中保存备用。1.1.2 cofilin-1片段PCR 1 反应体系：KOD polymerase(3-5核酸外切酶活性)2.5lKOD polymerase buffer5lMgSO42.5lDMSO（“万能溶剂”）2.5ldNTPMixture5lPrimerF（底物）1.5lPrimerR1.5lTemplate（模板）5lddH2O25lTotal50l2 PCR反应条件：94预变性3min94退火30s65延伸40s6840sgo to30个循环685min4forever3 琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测（1）配置浓度为1%的凝胶。称取琼脂糖0.3g，加入30ml 1TAE电泳缓冲液（Tris-乙酸电泳缓冲液）中，用微波炉加热2min，待凝胶稍冷却，加入2l EB（溴化乙锭，荧光染色剂）混匀后倾入凝胶铸槽中，插入梳子，并用玻璃棒驱除气泡，待凝胶完全凝结后拔除梳子。（2）把凝胶置于1TAE电泳缓冲液的电泳槽中，加样孔置于负极一侧，然后依次在加样孔中加入50l Marker、50l样品10l loading buffer(上样缓冲液，可以显示两条带，前面的蓝色的条带是溴酚蓝，代表的片段大小是 300bp，后面的有点绿色的条带是二甲苯青，代表的片段大小在4000bp左右)，盖上电泳盖，以100V电压进行电泳。（3）当Marker条带充分分开后即可停止电泳，将凝胶移至保鲜膜上，置于凝胶自动成像仪中分析。4 割胶回收PCR反应体系的扩增产物，用Omega Bio-Tek公司的Gel Extrection Kit进行回收：（1）将PCR扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下迅速切取含有目的条带的琼脂糖凝胶，放入灭菌的EP管中。DNA在紫外灯下曝光时间不超过30s。（2）称量凝胶块重量，以1g1ml进行计算，加入适量体积的binding buffer，55-65加热至凝胶完全融化（约710min），每隔23min震荡一次。（3）将Hibind DNA柱子套在2ml的收集管。将上述步骤（2）的溶液转移至Hibind DNA柱子中，10000g离心1min，弃滤液。（4）将柱子装回收集管中，加入300l binding buffer， 10000g离心1min，弃滤液。（5）将柱子装回收集管中，加入700l SPW wash buffer，10000g离心1min，弃滤液。（6）重复步骤（5）一次。（7）弃滤液，将柱子装回收集管中，13000g离心1min，以甩干柱子。（8）将柱子安置于灭菌的1.5ml的离心管上，在柱子中央处加入3050l的65预热的灭菌ddH2O，室温放置2min。13000g离心2min，洗脱DNA。1.2 表达载体pET-28a质粒的抽提接种含pET-28a的大肠杆菌DH5，37培养过夜。质粒抽提采用Omega Bio-Tek公司的Plasmid Mini Kit I进行质粒小抽：1 取20冰箱中保存的含pET-28a质粒的DH5菌种50l接种于4ml的LB培养基（含卡那霉素100g/ml）中，37，180rpm培养12h。划平板，活化菌种，置于37恒温箱中培养过夜，挑单菌落接种于4ml的LB培养基（含卡那霉素100g/ml）中（培养基中加卡那霉素抑制杂菌和不含目的基因的菌），37，180rpm培养12h。2 加入200l GPS buffer（硅胶柱平衡缓冲液，减少柱子中硅胶模的憎水基团，有利于结合核酸）于柱子中，室温放置2min，10000g离心2min，弃去掉收集管中的废液，柱子平衡完毕。3 将菌液移至灭菌的EP管中，室温下，10000g离心1min，彻底去除上清，收集沉淀菌体。4 加入200l Solution I/RNase A混合液，浮涡旋震荡使细菌充分悬浮。5 往重悬液中加入200l Solution ，轻轻颠倒EP管4-6次，使细菌裂解，室温放置2min，至溶液变成澄清。6 加入300l Solution ，温和颠倒数次，至溶液出现白色絮状沉淀。室温下，10000g离心10min。7 取出平衡后的柱子置于收集管上，将步骤6中的上清全部转移到柱子里。室温下，10000g离心1min，弃滤液。8 将柱子装回收集管中，加入500l HiBind buffer。室温下，10000g离心1min，弃滤液。9 将柱子装回收集管中，加入700l Wash Solution。室温下，10000g离心1min。重复该步骤一次。10 重复步骤9一次。11 弃滤液，将柱子装回收集管中，13000g离心1min，以甩干柱子。 12 将柱子安置于灭菌的1.5ml的离心管上，在柱子中央处加入3050l的65预热的灭菌ddH2O，室温放置2min。13000g离心2mi。跑1%的琼脂糖凝胶电泳检测质粒抽提纯度。-20冰箱中保存备用。1.3 cofilin-1片段和表达载体的双酶切用NdeI和XhoI分别酶切PCR产物cofilin-1 cDNA和表达载体pET-28a，37水浴反应4h，反应体系如下：表达载体酶切体系：PCR产物酶切体系：表达载体15lcofilin-1片段10l10H Buffer（代表缓冲液中盐浓度或成分不同）92l10H Buffer2lXhoI1lXhoI1lNdeI1lNdeI1lddH2O1lddH2O6lTotal20lTotal20l1.4 酶切产物的回收酶切产物分别进行1%琼脂糖凝胶电泳后，胶回收酶切产物。步骤同PCR反应产物胶回收。1.5 连接反应将PCR产物cofilin-1 cDNA的酶切回收产物和表达载体pET-28a的酶切回收产物于16连接24h，反应体系如下：cofilin-1 cDNA酶切回收产物18lpET-28a酶切回收产物6l10 T4 DNA ligase buffer3lT4连接酶3lTotal30l1.6 感受态大肠杆菌DH5的制备（将快速生长的大肠杆菌置于经低温预处理的低渗CaCl2溶液中，会造成细胞膨胀，诱导细胞成为感受态，细胞通透性发生改变，在短暂的热刺激后，细胞膜出现许多间隙，外源DNA被细胞吸收，通过复制，表达，实现遗传信息的转移，将转化后的细胞在选择性培养基上培养，筛选出带有外源DNA分子的阳性克隆）1 于-20冰箱中取出保存的大肠杆菌DH5菌种，于LB固体培养基上划平板，置于37恒温箱中培养过夜。挑单菌落，接种试管4ml LB培养基中，37， 180rpm培养12h。2 将试管中的菌液按1%的接种量接种到含50ml LB培养基的锥形瓶中，37，180rpm，培养2-3h，当OD600=0.30.5时，停止摇菌。3 将锥形瓶中的菌液分别倒入两个已灭菌的50ml离心管中，于冰上放置10min左右。4 4，4100rpm离心10min，于超净台里弃去上清，离心管倒滤纸上吸干。5 加入20ml预冷的0.1mol/L CaCl2重悬菌体，4，4100rpm离心10min，于超净台里弃去上清，离心管倒滤纸上吸干。6 加入2ml预冷的0.1mol/L CaCl2重悬菌体，加甘油至终浓度为15%，分装于1.5mlEP管中，转移-80保存备用。1.7 连接产物的转化1 将感受态大肠杆菌从-80冰箱中取出后，立即放在冰上，让其慢慢融化。2 将16l连接产物加入100L感受态大肠杆菌中，轻轻混匀，冰浴30min。3 将Eppendorf管放入42水浴箱中热冲击90s，再迅速冰浴1-2min。4 于EP管中加入400l LB培养基，置于摇床上，37，50rpm培养45min。5 将转化后的菌液涂于LB固体培养基上(含卡那霉素20g)，置于37恒温培养箱中倒置培养过夜。1.8 双酶切鉴定重组子1.8.1 双酶切鉴定和PCR鉴定1 从接有重组菌落的平板中挑取单菌，落接种于4ml LB培养基（含卡那霉素100g/ml）的试管中，37，180rpm培养12h，OMEGA质粒抽提试剂盒抽提质粒。3 限制性内切酶Nde I和Xho I酶切转化子质粒，将反应物置于37水浴箱中水浴4h。反应体系如下：质粒pET28a-cofilin-11l10H Buffer1lXhoI1lNdeI1lddH2O6lTotal10l4 电泳分析。将酶切产物、抽提出的未经酶切的质粒和PCR鉴定的反应产物一起进行琼脂糖凝胶电泳分析1.8.2 重组子的序列分析挑选经双酶切鉴定和PCR鉴定呈阳性的含重组子的菌落，接种到4ml LB培养基（含卡那霉素100g/ml）中，37、180rpm过夜12h，15甘油保种（甘油有隔绝空气，衡湿，调节渗透压，并在冷冻过程中起冷冻保护剂的作用）。并送样品英骏公司测序。2 cofilin-1在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达2.1 感受态大肠杆菌BL21(DE3)的制备具体方法和步骤同1.6。2.2 重组质粒pET28a-cofilin-1转化BL21大肠肝菌感受态细胞取鉴定正确的重组质粒pET-28a-cofilin-1转化入感受态的大肠杆菌BL21(DE3)，具体方法和步骤同1.7。于LB固体培养基（含卡那霉素20g）上划平板，并筛选阳性单克隆。2.3 cofilin-1的诱导表达挑单菌落，接种于4ml LB培养基（含卡那霉素100g/ml）中，37，180rpm培养至OD600=0.81.0。取1ml作未诱导对照，其余加IPTG（异丙基硫代半乳糖苷，是一种极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，诱导-半乳糖苷酶活性，在平板中加入IPTG，可以根据是否呈现白色菌落或噬菌斑而方便挑选出基因重组体）至终浓度1mmol/L，在37下诱导4h。2.4cofilin-1的鉴定2.4.1SDS-PAGE电泳检测1 电泳样品制备。离心收集诱导后的菌体，将菌体沉淀重悬100l ddH2O中，并加入2SDS-PAGE loading buffer混匀，100加热10min，4保存备用。上样量（l）=270/（菌体OD600浓缩系数）；（浓缩系数=菌液体积/样品体积）2 电泳样品制备及凝胶的灌制。12%SDS-PAGE蛋白电泳胶配制成分如下：成分分离胶(ml)浓缩胶(ml)30%丙烯酰胺溶液40.67ddH2O3.22.71.5M Tris-Cl(pH8.8)2-0.5M Tris-Cl(pH6.8)-0.510%SDS0.010.0410%APS0.010.06TEMED0.0050.002按照BIO-RAD公司蛋白质电泳的操作说明书安装好凝胶板。配置12SDS-PAGE分离胶，混匀后迅速灌胶，留出灌注浓缩胶所需空间（约1.5cm）。加水覆盖浓缩胶至玻璃板的边缘，室温下垂直放置30min。待分离胶完全凝固后，吸走用于覆盖的水。配置4的浓缩胶，在已凝固的分离胶上灌入浓缩胶，立即向浓缩胶溶液中插入上样梳子，小心避免混入气泡，室温下垂直放置30min。3 SDS-PAGE电泳。待浓缩胶完全凝固之后，取下并固定于电泳槽中，槽内加入新配的1Tris-甘氨酸电泳缓冲液，小心拔出上样梳子，按顺序加样。向槽外加入1Tris-甘氨酸电泳缓冲液后，即可连接电源，以恒压方式进行电泳。电泳条件：室温下，浓缩胶恒压50V，分离胶恒压100V，电泳时间约为2h，待溴酚蓝到达分离胶底部，即可停止电泳。4 染色。从电泳装置取出凝胶板，卸下玻璃板得到的凝胶切去浓缩胶，用蒸馏水清洗凝胶表面的缓冲液。室温下，用染色液浸泡染色，在摇床上温和振动4h以上。5 脱色。回收染色液，加入脱色液。室温下，在摇床上温和振动，直至凝胶背景颜色变浅，其间更换脱色液3次。2.4.2 Western blotting鉴定1 以2.3.2中的方法进行菌体总蛋白SDS-PAGE电泳。2 前期处理。根据点样孔的位置及蛋白mark的标记，切下需进行Western blotting检测的凝胶条带，测量并记录被切下凝胶的长与宽，将凝胶置于电转缓冲液中浸泡。剪6张滤纸和1张PVDF膜，大小与凝胶相同。滤纸浸入预冷的电转缓冲液， PVDF膜先用甲醇活化5min，再浸入预冷的电转缓冲液5min以上，需除去沾在膜上的气泡。3 转膜。按如下顺序放置湿转仪：阴极（黑面）海绵3张滤纸凝胶PVDF膜3张滤纸海绵阳极（白面）。每层需从左到右铺上，铺好后在其上面加小量预冷的电转缓冲液，在用试管从左到右滑动以排去叠层中可能残留的气泡。电转条件：4，100mA恒流转膜1h。4 封闭。从电转装置取下PVDF膜，剪下一角作为标记。用TBST清洗PVDF膜的表面，加入适量封闭液，室温下，在摇床上温和振动，封闭1h。5 一抗体和目的蛋白的结合。取出PVDF膜，用TBST清洗PVDF膜的表面，放入杂交袋，加适量1:3000稀释的一抗稀释液，尽可能排除气泡，封口，4过夜。取出PVDF膜，用TBST漂洗3次，每次5min。6 二抗体和一抗体的结合。将膜放入杂交袋内，加适量稀释后的辣根过氧化物酶标记的二抗稀释液，尽可能排除气泡，封口，室温下，在摇床上温和振动1h。取出PVDF膜，用TBST漂洗3次，每次5min。6 显影。取出PVDF膜，用滤纸小心吸干膜上的液体。将ECL液加入Eppendorf管内混匀，滴加在PVDF膜上，充分接触后，用滤纸小心吸干膜上的多余的液体，用保鲜膜包好。暗室中，加X光片（剪下一角以作标记）压片曝光，洗片顺序：显影液自来水定影液自来水。X光片晾干后，分析结果。2.4 重组菌的生长曲线1 接种50l重组菌到4ml LB培养基（含卡那霉素100g/ml）的试管中，在培养箱中，37，180rpm培养12h。2 转接1.5ml试管中的菌液到含50ml LB培养基的锥形瓶（含氨苄青霉素100g/ml）中（如果转化并连接成功的大肠杆菌具有抗氨苄能力），在培养箱中，37，180rpm培养。3 以接种前的LB培养基为空白，测定接种后菌液的OD600，每隔1h取样一次，以OD600和重组菌生长时间绘制生长曲线。2.5 最佳表达条件的筛选2.5.1 诱导剂IPTG的用量的筛选1 将重组菌以3%的接种量分别转接至含50ml LB培养基的锥形瓶（含氨苄青霉素100g/ml）中，37，180rpm培养。2 待OD600约等于0.60.8时，分别加入IPTG至终浓度为0mmol/L、0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L、1.5mmol/L、2.0mmol/L。37，180rpm培养4h。3 诱导4h后，取样测定菌液OD600，同时取出1ml菌液样品，如步骤2.4.1进行菌体总蛋白的SDS-PAGE电泳，检测cofilin-1蛋白的表达。电泳结果用凝胶成像仪的软件进行光密度扫描分析，确定重组蛋白在总蛋白中的含量，并选取cofilin-1蛋白表达量在菌体总蛋白中所占比例最高的为诱导剂IPTG的用量。2.5.2 诱导温度的筛选1 将重组菌以3%的接种量分别转接至含50ml LB培养基的锥形瓶（含氨苄青霉素100g/ml）中，37，180rpm培养。2 根据2.5.1的结果选取合适的IPTG浓度，待OD600约等于0.60.8时，加入IPTG后，分别于20、25、30、37进行诱导。180rpm培养8h。3 诱导8h后，取样测定菌液OD600，同时取出1ml菌液样品，如步骤2.4.1进行菌体总蛋白的SDS-PAGE电泳，检测cofilin-1蛋白的表达。电泳结果用凝胶成像仪的软件进行光密度扫描分析，确定重组蛋白在总蛋白中的含量，并选取cofilin-1蛋白表达量在菌体总蛋白中所占比例最高的为诱导温度。2.5.3 诱导时间的筛选1 将重组菌以3%的接种量分别转接至含50ml LB培养基的锥形瓶（含氨苄青霉素100g/ml）中，37，180rpm培养。2 根据2.5.1和2.5.2的结果选取合适的IPTG浓度和诱导温度，待OD600约等于0.60.8时，加入IPTG后，分别于4h、8h、10h、12h、16h、20h、24h取样测定菌液OD600，同时取出1ml菌液，样品经处理后，置4保存备用。3 待样品收集完成后，如步骤2.4.1进行菌体总蛋白的SDS-PAGE电泳，检测cofilin-1蛋白的表达。电泳结果用凝胶成像仪的软件进行光密度扫描分析，确定重组蛋白在总蛋白中的含量，并选取cofilin-1蛋白表达量在菌体总蛋白中所占比例最高的为诱导时间。3 cofilin-1蛋白纯化与鉴定3.1 菌体裂解上清的制备1 称量菌体湿重，以1：10的比例加入PBS（pH7.8）缓冲液（磷酸缓冲液），涡旋震荡使菌体重悬，直到没有菌块存在。2 在冰浴条件下，超声破碎菌液，参数功率条件：800W；超声时间3s；间歇时间6s；超声循环99次，超声次数：23次。3 4，17000g离心30min，分别收集收集上清和沉淀。4 如步骤2.4.1进行SDS-PAGE电泳检测。3.2 cofilin-1重组蛋白的纯化1 镍琼脂糖凝胶（固定金属离子亲和色谱，利用蛋白质表面的氨基酸，如组氨酸与多种过渡金属Cu，Zn,Ni,Co,Fe发生特殊的相互作用，利用这个原理把富含这类氨基酸的蛋白质分离出来）预处理。取出镍琼脂糖凝胶8g，放入蒸馏水中充分搅拌清洗，静置2h后倾去上层蒸馏水。将层析柱装好垂直固定于滴定架上，使镍琼脂糖凝胶沿玻璃棒倒入柱内，并用PBS（pH7.8）冲洗。2 层析柱平衡。用100200ml 0.5mol/L NaOH缓冲液平衡柱子，静置30min，用蒸馏水冲洗至流出液pH呈中性；再用100200ml 0.1mol/L EDTA（络合剂，和碱金属，稀土元素和过渡金属形成稳定的水溶性络合物）缓冲液平衡柱子，静置30min，蒸馏水冲洗。处理完后，将镍琼脂糖凝胶浸泡于0.5mol/L硫酸镍中过夜。控制流速1ml/min。 3 加样及洗脱穿透峰1。用PBS（pH7.8）将多余的硫酸镍冲洗下来，待流出液的吸光值不再变化时，加入样品，待样品液面与柱面相切时，再加入PBS（pH7.8）洗脱。控制流速1ml/min，检测波长为280nm，收集洗脱峰。4 洗脱杂蛋白峰2。待流出液的吸光值不再变化时，用30mM/L咪唑的缓冲液洗脱杂蛋白，流速为2ml/min，检测波长为280nm。留样电泳，收集洗脱峰。5 洗脱目的蛋白峰3。待流出液的吸光值不再变化时，用300mM/L咪唑的缓冲液洗脱cofilin-1重组蛋白，流速为2ml/min，检测波长为280nm。收集洗脱峰。6 层析柱再生。用0.5mol NaOH和纯水各流洗200ml，再用20%的乙醇流洗100ml，流速为2ml/min，放置4冰箱保存。7 SDS-PAGE电泳。以2.3.2中的方法对纯化中收集的样品进行SDS-PAGE电泳检测。3.3 cofilin-1重组蛋白脱咪唑（咪唑能竞争性的结合到柱子上，使带His标签的目的蛋白丧失了结合位点，从而被洗脱下来）1 ephadexG-25（交联葡聚糖凝胶的种类有G-10、G-15、G-25、G-50、G-75、G-100、G-150、和G-200。G-25为每克凝胶膨胀时吸水2.5克）预处理。取出ephadexG-25约30g，放入蒸馏水中充分搅拌清洗，静置2h后倾去上层蒸馏水。将层析柱装好垂直固定于滴定架上，使镍琼脂糖凝胶沿玻璃棒倒入柱内，并用超纯水冲洗。2 层析柱平衡。用300ml超纯水冲洗，控制流速1ml/min，检测波长为280nm，。 3 待流出液的吸光值不再变化时，将3.2制备的cofilin-1重组蛋白上样，流速为3ml/min。4 用超纯水1洗脱，流速为3ml/min，检测波长为280nm。收集洗脱峰。当蛋白峰下降时，每隔1min收集少量液体加入20l的硝酸银混匀，当出现白色沉淀时，停止收集溶液。5 层析柱再生。用0.5mol/L NaOH和纯水各流洗200ml，再用20%的乙醇流洗100ml，流速为2ml/min，放置4冰箱保存。6 SDS-PAGE电泳。以2.3.2中的方法对纯化中收集的样品进行SDS-PAGE电泳检测。7 将脱咪唑后的蛋白溶液置于-20过夜，待溶液结冰后，放入冷冻干燥机中冻干成粉末，收集后放-20保存。3.4 cofilin-1重组蛋白分子量的测定cofilin-1蛋白送暨南大学生命与健康工程研究院用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）测定其精确分子量。4 cofilin-1重组蛋白生物活性的检测4.1 样品前处理称取粉末状的cofilin-1重组蛋白及actin蛋白（即“肌动蛋白”， -Actin是PCR常用的内参，-Actin抗体是Western Blot很好的内参指数）分别溶于适量的双蒸水中，充分溶解。置于冰上待用。4.2 BCA法测定蛋白浓度BCA法原理是：在碱性的条件下，二价铜离子可以被蛋白质还原成一价铜离子，BCA与一价铜离子结合形成稳定的紫蓝色复合物，该水溶性的复合物在562nm处显示强烈的吸光性，吸光度和蛋白浓度有正比关系。（1） BSA标准曲线的制备。准备8个1.5mL EP管，按照下面配制浓度分别为0g/l、0.025g/l、0.05g/l、0.1g/l、0.2g/l、0.3g/l、0.4g/l、0.5g/l的BSA标准溶液。编号12345678(0.5mg/ml) BSA(l) 0501002004006008001000PBS（l）10009509008006004002000Total volume（l）10001000100010001000100010001000 （2） 蛋白样品的处理。 将蛋白样品用PBS稀释后，涡旋混匀后，加入96孔板，每个样品3个复孔，每个孔加入10l。将BCA试剂按比例混合后，每个孔加入100l。37放置30min。用酶标仪检测，波长为570nm。4.3 非变性PAGE电泳检测1 准备Eppendorf管标记编号19。将样品分别加入EP管中，actin蛋白溶液向19管每管分别加入20mol/L；DNase I蛋白溶液向29管每管分别加入16mol/L；cofilin-1蛋白溶液向39管每管分别加入5mol/L、10mol/L、12.5mol/L、15mol/L、20mol/L、25mol/L、30mol/L。 最后每管分别加入8G-buffer和双蒸水，使终浓度为1G-buffer，终体积为16l，充分混匀，整过程在冰上进行。2 将Eppendorf管放入22水浴箱中，反应20min。3 取出Eppendorf管置于冰上，加入5非变性PAGE loading buffer混匀。4 10%非变性PAGE蛋白电泳胶配制成分如下：成分分离胶(ml)浓缩胶(ml)30%丙烯酰胺溶液3.330.53ddH2O3,872.931.5M Tris-Cl(pH8.8)2.5-0.5M Tris-Cl(pH6.8)-0.510%APS0.010.06TEMED0.0040.0065 如步骤2.4.1进行非变性PAGE蛋白电泳。电泳条件：4，浓缩胶恒压30V，分离胶恒压70V，电泳时间约为5h，待溴酚蓝到达分离胶底部，即可停止电泳。5 cofilin-1重组蛋白多克隆抗体的制备5.1 动物免疫步骤1 样品的处理。将冻干的粉末状的cofilin-1重组蛋白溶解于PBS中，终浓度为1mg/mL，用0.2m的滤器过滤除菌。把除菌后的cofilin-1重组蛋白溶液与弗氏完全佐剂以1：1完全混合制备成 （油包水乳状液，能够非常有效的诱导产生高浓度的抗体。弗氏完全佐剂含结核分枝杆菌的细胞壁成分，用于初次免疫刺激。）。cofilin-1混合物终浓度浓度为0.5mg/ml。2 初次免疫。准备家兔4只，取免疫前血清为阴性对照组，向家兔背部的皮下多点注射cofilin-1与弗氏完全佐剂的混合物，共注射1ml。3 加强免疫。每隔10天，进行臀部的皮下多点注射cofilin-1与弗氏不完全佐剂（不完全佐剂是油剂（石蜡油或植物油）与乳化剂（羊毛脂或吐温（Tween）80）相混合而成。在不完全佐剂中加入死的分枝杆菌，即成为费氏完全佐剂。就是刺激机体产生免疫应答）的混合物，cofilin-1混合物终浓度浓度为0.5mg/ml，共注射1ml。第三次免疫后10天，耳动脉抽血，4过夜，第二天离心分离血清，ELISA法检测抗血清的效价。当效价合格后，便可停止免疫，否则继续加强免疫。4 抗血清初步处理。抗血清效价达到要求后，剪断兔的颈动脉采血，所采集的血液在室温下放置2h左右，再放置4过夜，第二天4000g离心4min收集抗血清，抗血清分装后放-20冰箱保存。5.2 ELASA检测抗血清的效价1 包被。用包被缓冲液（一般Elisa包被用的缓冲液都是偏碱性的碳酸盐缓冲液（pH8-9)，目的就是要让被包被的蛋白质暴露较多的阴性集团，更稳定的吸附到板子上。）稀释cofilin-1粉末，至终浓度为1g/mL。将溶液加入酶标板内，每孔100l，4过夜。2 洗涤。将酶标板中液体甩干，用洗涤液洗涤3次，每次3min。3 封闭。每孔加入封闭液100l，37放置2h。4 洗涤。将酶标板中液体甩干，用洗涤液洗涤3次，每次3min。5 一抗与蛋白的结合反应。将抗血清用稀释液稀释成1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000、1:128000、1:256000，每孔100L，每个浓度设置2个复孔，37放置2小时。6 洗涤。将酶标板中液体甩干，用洗涤液洗涤3次，每次3min。7 酶标抗体反应。用稀释液将HRP标记的羊抗兔IgG-按1:3000稀释，每孔100L，37保温2小时。8 洗涤。将酶标板中液体甩干，用洗涤液洗涤3次，每次3min。9 显色.。加100l TMB，37避光放置15min，加入50l 2mol/L H2SO4终止显色。利用酶标仪检测结果。使用条件：波长为450nm，参比波长为630nm读数。多克隆抗体的效价公式：阴性对照OD值记为N，免疫后抗血清OD值记为P，若P/N2.1，且P-N0.2，即判为阳性结果，以出现阳性反应的最高稀释度作为抗体的效价。5.3 cofilin-1抗体的纯化与检测5.3.1 盐析操作步骤1 取15ml的抗cofilin-1兔血清与15ml生理盐水充分混合。向混合液慢慢滴加饱和硫酸铵30ml（硫酸铵饱和度为50%），并不断搅拌至百色浑浊物出现，4放置3小时以上，使其充分沉淀。2 3000rpm离心20min，弃上清，以生理盐水溶解沉淀至30ml，慢慢滴加饱和硫酸铵20ml（硫酸铵饱和度为40%），并不断搅拌至百色浑浊物出现，4放置3小时以上，使其充分沉淀。3 3000rpm离心20 min，弃上清，以生理盐水溶解沉淀至30ml，慢慢滴加饱和硫酸铵14.7ml（硫酸铵饱和度为33%），并不断搅拌至百色浑浊物出现，4放置3小时以上，使其充分沉淀。4 3000rpm离心20min，弃上清，将所得沉淀物以的PBS(pH7.4)溶解至15ml。5 将溶液分装到超滤离心管，3000rpm离心20min，弃离心管下层滤液，向上层溶液再加入PBS混合。6 重复步骤5多次，将脱盐后的蛋白溶液置于4保存备用。5.3.2 DEAE离子交换层析1 DEAE-SephadexA-50预处理。取出DEAE-SephadexA-50（以下简称A-50）8g，放入蒸馏水中充分搅拌清洗，静置2h后倾去上层蒸馏水。将层析柱装好垂直固定于滴定架上，A-50沿玻璃棒倒入柱内，并用PBS（pH7.4）冲洗。2 层析柱平衡。用100200ml 0.5mol/L NaOH缓冲液平衡柱子，静置30min，用蒸馏水冲洗至流出液pH呈中性；再用100200ml 0.5mol/L HCl缓冲液平衡柱子，静置30min，用蒸馏水冲洗至流出液pH呈中性；用100200ml 0.5mol/L NaOH缓冲液平衡柱子，静置30min，用蒸馏水冲洗至流出液pH呈中性。处理完后，将A-50浸泡于PBS（pH7.4）中过夜。控制流速1ml/min。3 加样及洗脱。向层析柱内加入PBS（pH7.4），待流出液的吸光值不再变化时，加入样品，待样品液面与柱面相切时，再加入PBS（pH7.4）洗脱。控制流速1ml/min，检测波长为280nm。4 收集样品。在开始洗脱的同时就以试管分部收集样品。5 层析柱再生。用NaCl洗脱蛋白质，待流出液的吸光值不再变化时，再以蒸馏水洗去柱中盐。然后按层析柱平衡的过程将A-50再处理一遍。用无水酒精洗2次，放置4冰箱保存。6 SDS-PAGE电泳。以2.3.2中的方法对纯化中收集的样品进行SDS-PAGE电泳检测。5.4 纯化抗体的检测5.4.1 纯化抗体效价的测定以5.2中的方法对纯化后抗体的效价进行ELASA检测。5.4.2 western blotting鉴定多克隆抗体的特异性1 细胞总蛋白的提取 用胰酶分别消化MEF和Atg细胞，室温下，放置12min。观察中方瓶底部起白色雾状时，将消化液倒掉，用吸管将未倒净的消化液洗掉。加入6ml的培养液，用吸管轻轻吹打使细胞充分悬浮，吸出3ml分装到另一中方瓶，再加入3ml培养液混匀，放培养箱内，37培养2天，待瓶内细胞长满后，即可进行以下操作：（1）用胰酶消化细胞，室温下，放置12min。（2）将消化液倒掉，用吸管将未倒净的消化液洗掉。（3）加入6ml的培养液，用吸管轻轻吹打使细胞充分悬浮。（4）将悬浮细胞液转移到15ml离心管内，室温下，3000rpm离心5min。（5）取出离心管，倒掉培养液，倒置在滤纸上，吸尽培养液。（6）加入1ml PBS，涡旋混匀，室温下，3000rpm离心5min。（7）倒掉PBS，倒置在滤纸上，吸尽PBS。（8）加入60l PIPA裂解液（含2%的PMSF），立即置于冰上，裂解30min，每5min涡旋混匀，混匀后立即置于冰上。4，12000rpm离心15min（9）取上清置于Eppendorf管中，-20保存备用。2 western blotting具体操作步骤参照2.4.2