外泌体蛋白质组

外泌体参与肺炎相关的急性胰腺炎 14级生技 目录 CONTENTS 第一部分 | 摘要背景 第二部分 | 材料方法 摘要背景 1 Abstract 急性胰腺炎的常急性胰腺炎的常见并发症是肺损见并发症是肺损伤相关的全身炎伤相关的全身炎症反应。尽管研症反应。尽管研究发现在局部和究发现在局部和全身都会产生促全身都会产生促炎因子，但对疾炎因子，但对疾病的致病机制仍病的致病机制仍不清楚。不清楚。 外泌体作为细外泌体作为细胞间通讯系统出胞间通讯系统出现，有转运膜包现，有转运膜包被的蛋白质和小被的蛋白质和小分子分子RNA，并保，并保护其免受退化的护其免受退化的作用。作用。 用牛磺胆酸盐用牛磺胆酸盐诱导的大鼠急诱导的大鼠急性胰腺炎模型，性胰腺炎模型，评估外泌体在评估外泌体在全身性炎症反全身性炎症反应程度的作用应程度的作用 急性胰腺炎急性胰腺炎 外泌体外泌体 大鼠急性胰腺炎模型大鼠急性胰腺炎模型 蛋白质组蛋白质组 诱导胰腺炎升高了循环外泌体的浓度，得到不对照组动物丌同的蛋白质组图谱 研究概述 PKH26染色和跟踪实验表明，循环外泌体能到达肺泡隔间然后被巨噬细胞吞噬 体外实验表明，外泌体在炎症条件下活化肺泡巨噬细胞并使其朝亲炎症性分化 跟踪实验还表明，肝脏保留了来自腹腔的大部分外泌体 对急性胰腺炎的循环外泌体进行蛋白质组分析，提示多器官来源的囊泡对外泌体的作用效果像一个来源的 外泌体可能是作为相关介质参不肺损伤相关的急性胰腺炎 材料方法 2 分离外泌体 1 4 3 6 2 5 分离外泌体分离外泌体 血浆样本（1ml ) 4 2 000 g 离心 10min 10 000 g 离心 30min 回收上清 8ml PBS 30%蔗糖垫 120 000 g 超速离心 70 min 去蔗糖 PBS洗涤 0.22m滤膜过滤 120 000 g 超速离心 70 min （清除外泌体相关非特异性蛋白和大分子蛋白） 从PAAF分离纤维颗粒 （纤维蛋白含量高） 分离上清 分离出的外泌体定量分析 测蛋白质含量 样本用5U/ml凝血酶处理10min 10 000 g 离心 5min 电子显微镜 3 4 2 1 4%甲酸铀酰负染甲酸铀酰负染 风干网格风干网格 吸附在聚乙烯醇缩甲吸附在聚乙烯醇缩甲醛树脂包被的镍网格醛树脂包被的镍网格 外泌体结合外泌体结合 4%多聚甲醛多聚甲醛 5 电子显微镜观察 SDS-PAGE和Western blot 从RIPA buffer （含蛋白酶抑制剂）提外泌体 Odyssey红外成像系统，观察免疫条带 细胞裂解液作阴性对照 洗印记，孵二抗（Dylight-800) 室温1.5h Cd63抗体（1:500）隔夜孵化 PBS+3%BSA封闭1h 含（1:10 PAAF）血浆处理外泌体5min 外泌体 降解实验 转到PVDF膜 12%SDS-PAGE分离 体外巨噬细胞活化 巨噬细胞暴露在巨噬细胞暴露在2g/ml的循环外泌体的循环外泌体 从对照组动物供体从对照组动物供体 获得含外泌体的肺获得含外泌体的肺 泡巨噬细胞培养泡巨噬细胞培养16h 外泌体染色和跟踪分析 PKH26标标 记外泌体记外泌体 300 kDa Nanosep 超滤离心管超滤离心管 PBS洗洗3次洗次洗 去多余去多余 染料染料 3%BSA停停 止反应止反应1min 实验11 实验2 AP血浆样本得到的Exo-PKH26以 4ml/h的流速注射下腔静脉15min PAAF样本中得到的Exo-PKH26 以4ml/h的流速注射15min 肝门静脉 下腔静脉 处死，取肺泡巨噬细胞 （注射肝门静脉）取肝 荧光免疫分析 每组PKH26染PBS作对照 荧光免疫检测 体外条件下，通过肝门静脉向肝灌注4% 40ml多聚甲醛 PBS+1.5%BSA、5%FCS封闭 切10m样本 房子载玻片上 样本组织在异戊烷冰浴冻存（O.C.T混合物） 蔗糖梯度 （10%-40%） 冷冻保存 M-CD163（1:100）单克隆抗体、M- Alexa488二抗预处理 切成小块 PBS洗 荧光免疫分析 3 4 2 1 分离肝细胞分离肝细胞50 g 离心离心 3 min 将每次获得的上清液合并将每次获得的上清液合并 180 g 离心离心 回收回收KC 取肝，切成小块，用刮刀使取肝，切成小块，用刮刀使其分散，将悬液用孔径为其分散，将悬液用孔径为100 m 的细胞过滤器过滤的细胞过滤器过滤 向肝部体外注射含向肝部体外注射含0.05% IV型胶原酶的汉型胶原酶的汉克平衡盐溶液克平衡盐溶液 5 KC加到24孔板底部，附着2h除去非粘连细胞 观察肝细胞的形态， 用KC对抗CD163荧光染色检测分离细胞的 纯度 LC-MS分析 蛋白提取物用测序级蛋白酶裂解，蛋白提取物用测序级蛋白酶裂解，FASP (超滤管酶解超滤管酶解) ，每，每个胰蛋白酶多肽混合物用个胰蛋白酶多肽混合物用TMTs标记。标记。 混合6个标记过的缩氨酸，浓缩，用C18 SPE滤芯脱盐。 标记的样本通过分成标记的样本通过分成3份，用带有份，用带有nanoESI 离子源的离子源的 LTQ-Orbitrap XL 进行进行LCMS分析分析 用用Protein Discoverer软件搜索数据库通过以下参数，软件搜索数据库通过以下参数，: 源性源性容差性容差性, 20 ppm;片段公差片段公差, 0.8 Da； 酶，胰朊酶酶，胰朊酶, 未酶切位点未酶切位点, 1； 固定修饰固定修饰, 半胱氨酸碘乙酰胺化，半胱氨酸碘乙酰胺化，TMTsixplex (N-端端, K) ；修改变量，氧化修改变量，氧化 (M). 用用DanteR 相关定量和统计学分析相关定量和统计学分析TMT-标记的肽段标记的肽段 THANK YOU!