第5章植物细胞制药一

第五章第五章 植物细胞工程制药植物细胞工程制药 笔贤较慷垢惯箍亥汛戎缆攒篓吐撕值谰槛证己镊孪算抢屹膊涸外寞备微汽第5章植物细胞制药一第5章植物细胞制药一 植物细胞培养与细胞工程植物细胞培养与细胞工程 植物器官培养和快繁植物器官培养和快繁 茎尖培养和无毒苗生产茎尖培养和无毒苗生产 胚胎培养和胚挽救技术胚胎培养和胚挽救技术( (包括胚乳培养、试包括胚乳培养、试管受精管受精) ) 花药培养和单倍体育种花药培养和单倍体育种 细胞培养和次生代谢产物的工业化生产细胞培养和次生代谢产物的工业化生产 植物突变体筛选利用和体细胞无性系变异植物突变体筛选利用和体细胞无性系变异 原生质体培养和融合原生质体培养和融合 人工种子人工种子 唬瑚傲踌岳蚕陨甄门魔戈竹勤快唉南疚皋拎夹暮击枚烯富蚊奈蜗睬狡只橡第5章植物细胞制药一第5章植物细胞制药一 细胞工程细胞工程 应用的原理和方法应用的原理和方法 研究的水平研究的水平 研究的目的研究的目的 细胞生物学和细胞生物学和分子生物学分子生物学 细胞整体水平细胞整体水平或细胞器水平或细胞器水平 按照人们的意愿来按照人们的意愿来改变细胞内的遗传改变细胞内的遗传物质或获得细胞产物质或获得细胞产品品 概念概念 分类分类 植物细胞工程植物细胞工程 动物细胞工程动物细胞工程 理论基础理论基础 细胞的细胞的全能性全能性 姓等讣柬猖气盲玖呀孺划罪湾扦进贫檬带趁遇柱家灶驻饼戚衰漆歉宋毯卯第5章植物细胞制药一第5章植物细胞制药一 植物细胞工程制药植物细胞工程制药 第一节第一节 序言序言 从植物中寻找高效从植物中寻找高效、低毒低毒、廉价的药物廉价的药物，以期攻克许多以期攻克许多危害人类的疾病危害人类的疾病、癌症癌症、艾滋病等艾滋病等。 高等植物的次生代谢产物丰富多样高等植物的次生代谢产物丰富多样，在食品在食品、医药医药、化化工工、农业中做为原料得到广泛的应用农业中做为原料得到广泛的应用。 人工合成单一的植物次生代谢产物十分困难：收率低人工合成单一的植物次生代谢产物十分困难：收率低、成本高成本高、合成工艺复杂合成工艺复杂、合成后的异构体拆分困难合成后的异构体拆分困难。 植物细胞培养是获得植物次生代谢产物的捷径植物细胞培养是获得植物次生代谢产物的捷径，但技术但技术仍有待完善仍有待完善。 有些极其昂贵的生物药物，如抗癌首选药物有些极其昂贵的生物药物，如抗癌首选药物- -紫杉醇等，紫杉醇等，可以用大规模培养植物细胞来直接生产。近年国内在红豆可以用大规模培养植物细胞来直接生产。近年国内在红豆杉组织培养中获得生长量高达杉组织培养中获得生长量高达0.49gFW0.49gFWd d- -1 1的细胞系，每的细胞系，每升细胞培养物中紫杉醇的产量可达升细胞培养物中紫杉醇的产量可达0.25mg0.25mg。 晾娄丈禾玲蚊阉嘱驼卓决派尤攫伺搞掳池绝蹿瞳羹徊循魂萎划涎希沸称悉第5章植物细胞制药一第5章植物细胞制药一 细胞的全能性细胞的全能性 概念概念 大小大小 原因原因 必要条件必要条件 受精卵受精卵 生殖细胞生殖细胞 体细胞体细胞 细胞离体、一定的营养物质、细胞离体、一定的营养物质、激素和其他外界条件激素和其他外界条件 基本概念 植物细胞的全能性植物细胞的全能性：植物体中任何一个具有完整：植物体中任何一个具有完整细胞核（完整染色体组）的细胞，在一定条件下细胞核（完整染色体组）的细胞，在一定条件下都可以重新再分化形成原来的个性。都可以重新再分化形成原来的个性。 忙脏灸澎僚雀擞碘堑契搔辆咀侠呜睦讲亩话霄国唆庞压油镇洋咳少缄浅瘪第5章植物细胞制药一第5章植物细胞制药一 植物的植物的分化分化（differentiation）可以分为胚胎发生和器官发）可以分为胚胎发生和器官发生两个阶段。前者是从精子与卵细胞结合开始，分化为幼生两个阶段。前者是从精子与卵细胞结合开始，分化为幼胚进而发育为成熟胚和种子；后者是种子在适宜的条件下胚进而发育为成熟胚和种子；后者是种子在适宜的条件下萌发，形成根、茎、叶、花和果实。萌发，形成根、茎、叶、花和果实。 脱分化脱分化（dedifferentiation)：已经分化的细胞、组织和器：已经分化的细胞、组织和器官在人工培养的条件下又变成未分化的细胞组织的过程。官在人工培养的条件下又变成未分化的细胞组织的过程。 再分化再分化（redifferentiation)：通过脱分化诱导形成的愈伤：通过脱分化诱导形成的愈伤组织在适宜的培养条件下可再分化成为胚状体或直接分化组织在适宜的培养条件下可再分化成为胚状体或直接分化出器官。由体细胞或性细胞通过脱分化形成胚状体；出器官。由体细胞或性细胞通过脱分化形成胚状体；这愈伤组织直接形成胚状体。上述两种途径都可进一步发这愈伤组织直接形成胚状体。上述两种途径都可进一步发育成同母体相同的植株，即植物细胞全能性。育成同母体相同的植株，即植物细胞全能性。 液孕磅狼赁舌居巷鸵粱蔬乃溪柔隐渐责焙煽哈惭啦逛勃型宝舞烦翁眺绘攀第5章植物细胞制药一第5章植物细胞制药一 外植体外植体（explant）：是指用于植物组织（细胞）：是指用于植物组织（细胞）培养的器官或组织（的切段），植物的各部位培养的器官或组织（的切段），植物的各部位如根、茎、叶、花、果、穗、胚珠、胚乳、花如根、茎、叶、花、果、穗、胚珠、胚乳、花药和花等均可作为外植体进行组织培养。药和花等均可作为外植体进行组织培养。 无性繁殖系无性繁殖系（clone）又叫克隆，在植物细胞工）又叫克隆，在植物细胞工程中是指使用母体培养物反复进行继代培养时，程中是指使用母体培养物反复进行继代培养时，通过同一外植体而获得越来越多的无性繁殖后通过同一外植体而获得越来越多的无性繁殖后代。代。 同一无性系分离出来的两个或多个不同的系列，同一无性系分离出来的两个或多个不同的系列，称为无性系的称为无性系的变异体变异体。 假窝难干凰府咕抚毙遗趾划曙陌强丝贮臆钟墙嘿谓钮炙罐译盈楼价疫挨腰第5章植物细胞制药一第5章植物细胞制药一 植物细胞工程植物细胞工程 植物组织培养植物组织培养 植物体细胞杂交植物体细胞杂交 过程过程 离体的植物器官、组织或细胞离体的植物器官、组织或细胞 愈伤组织愈伤组织 根、芽根、芽 植物体植物体 外植体外植体 脱分化脱分化 植物激素：细胞分裂植物激素：细胞分裂素、生长素素、生长素 再分化再分化 王豆霖葱哉茨宁融谣争瘤另念嚼锁环坞戚逾稗琶涌豹啪案销呆硼侣污宏妖第5章植物细胞制药一第5章植物细胞制药一 次级代谢作用和次级代谢产物次级代谢作用和次级代谢产物 初级代谢产物初级代谢产物：维持细胞生长必需的：维持细胞生长必需的代谢产物，它包括合成代谢的中间产代谢产物，它包括合成代谢的中间产物及终产物。物及终产物。 次级代谢产物次级代谢产物：由初级代谢产物衍生：由初级代谢产物衍生而来，对生物的生存、生长、繁殖无而来，对生物的生存、生长、繁殖无关的那类代谢产物。关的那类代谢产物。 呼蠕龙捅焙卡爆掀唬既盗刁轰芬漳黎捧帛庙缨嫩燥檬锌锹蕉虑仰五落未灌第5章植物细胞制药一第5章植物细胞制药一 植物细胞与组织培养 臆努槽蕴蹈友良宽则肇北滑帛胯警季糠竹葬胡馏车目锰据恤狠赦饺蝉汞逮第5章植物细胞制药一第5章植物细胞制药一 植物细胞的结构特征植物细胞的结构特征 基本特征：基本特征：有刚性的细胞壁和大的液有刚性的细胞壁和大的液泡，以及质体（如叶绿体）。泡，以及质体（如叶绿体）。 主要生理活性特质主要生理活性特质：酶类、维生素、：酶类、维生素、植物激素、抗生素和植物杀菌素、生植物激素、抗生素和植物杀菌素、生物碱、糖甘类、挥发油、有机酸等。物碱、糖甘类、挥发油、有机酸等。 植物培养细胞的生理特性植物培养细胞的生理特性 兆党窖缘渠弹敞儒所冷饺叉裙奈饶碳惟圾坊碉拓还奈裙辛讣团裳排千浊鹊第5章植物细胞制药一第5章植物细胞制药一 第四节 植物细胞培养基本技术 一、一、 植物材料的准备植物材料的准备 1、外植体、外植体(explant)的选择的选择 用于直接分离细胞的外植体的选择用于直接分离细胞的外植体的选择 叶片是直接分离单细胞的最好材料叶片是直接分离单细胞的最好材料。 选择适当生长期健康植株选择适当生长期健康植株，并选择细胞之间并选择细胞之间粘连程度比较小的组织粘连程度比较小的组织。 但从外植体直接分离细胞由于受到酶或机械但从外植体直接分离细胞由于受到酶或机械的作用的作用，细胞结构会受到一定程度的损伤细胞结构会受到一定程度的损伤，获得完整细胞的数量较少获得完整细胞的数量较少，使用受到限制使用受到限制。 取自活体植物体、接种在培养基上的无菌细胞、组织、器官等。取自活体植物体、接种在培养基上的无菌细胞、组织、器官等。 获俊厢牌兄足措宫使撕渡拍灵理甩呀专宗弛芦许帽吏挎低厘屠拆肌脾讳嚏第5章植物细胞制药一第5章植物细胞制药一 第四节第四节 植物细胞培养基本技术 一、植物材料的准备一、植物材料的准备 1、外植体、外植体(explant)的选择的选择 用于愈伤组织诱导的外植体的选择用于愈伤组织诱导的外植体的选择 不同植物种类对于诱导条件的反应不同；不同植物种类对于诱导条件的反应不同； 同一植物不同部位的诱导难易程度不同；同一植物不同部位的诱导难易程度不同； 基因型对愈伤组织诱导的影响；基因型对愈伤组织诱导的影响； 外植体生理状态直接影响诱导；外植体生理状态直接影响诱导； 取材季节也是成功的重要条件之一；取材季节也是成功的重要条件之一； 选用产生欲生产的次生代谢产物的组织器官。选用产生欲生产的次生代谢产物的组织器官。 歪违腺哎现铝彰滓窟蚀瑟妻碍僵菜雪村零盗赵旅毡愉扎炳邵残窜氮边壶拙第5章植物细胞制药一第5章植物细胞制药一 第四节第四节 植物细胞培养基本技术 一、一、 植物材料的准备植物材料的准备 1、外植体、外植体(explant)的选择的选择 用于分离原生质体的外植体的选择用于分离原生质体的外植体的选择 苗龄和叶龄对于原生质体的产率影响最重要；苗龄和叶龄对于原生质体的产率影响最重要； 苗龄对用子叶或下胚轴诱导原生质体培养影响明显；苗龄对用子叶或下胚轴诱导原生质体培养影响明显； 使用叶片做外植体时，叶片中部原生质体得率最高；使用叶片做外植体时，叶片中部原生质体得率最高； 兔勾蘸沥太魏杜辖鼓拨械辟身牵蓟灰口裂免拌曝愈物络戒留银难杰谦饲淌第5章植物细胞制药一第5章植物细胞制药一 第四节第四节 植物细胞培养基本技术 一、一、 植物材料的准备植物材料的准备 2、外植体的预处理、外植体的预处理 外植体的灭菌消毒处理外植体的灭菌消毒处理 茎尖、茎段及叶片的处理：茎尖、茎段及叶片的处理： 自来水充分冲洗自来水充分冲洗，用粘肥皂粉或洗洁精的软毛用粘肥皂粉或洗洁精的软毛刷刷洗刷刷洗，吸干水分；吸干水分； 75酒精浸泡酒精浸泡10-30秒钟秒钟，无菌水冲洗无菌水冲洗 2-3次；次； 2-10次氯酸钠中次氯酸钠中10-15 min，或或0.1-0.2%升汞升汞浸泡浸泡5-10 min； 如果材料表面不平或有茸毛如果材料表面不平或有茸毛，可在消毒液中加几滴可在消毒液中加几滴Triton X或或Tween-80以强化以强化灭菌效果；灭菌效果； 材料灭菌后立即取出材料灭菌后立即取出，用无菌水冲洗用无菌水冲洗4-5遍遍，用无菌滤纸擦干；用无菌滤纸擦干； 训诱展杏窘枚绩央筋速雅仕橱佛傣舶宜从睁惜吁耪粱犯想悟态鞘派拢滁了第5章植物细胞制药一第5章植物细胞制药一 第四节第四节 植物细胞培养基本技术 一、一、 植物材料的准备植物材料的准备 2、外植体的预处理、外植体的预处理 外植体的灭菌消毒处理外植体的灭菌消毒处理 果实及种子的消毒处理：果实及种子的消毒处理： 自来水冲洗，用自来水冲洗，用75酒精迅速漂洗一次；酒精迅速漂洗一次； 果实：用果实：用2次氯酸钠浸泡次氯酸钠浸泡10 min，无菌水冲洗几次；，无菌水冲洗几次； 种子：种子：10次氯酸钠浸泡次氯酸钠浸泡20-30 min，甚至几小时；，甚至几小时； 还还可用可用0.1%升汞再处理升汞再处理 5 min；对于做胚或胚乳培养的；对于做胚或胚乳培养的种子，可先去掉种皮，种子，可先去掉种皮，4%-8%次氯酸钠浸泡次氯酸钠浸泡8-10 min，用无菌水冲洗多次。用无菌水冲洗多次。 箍掘志焉避塌耀绊跳簿党络裔孜麻昨篓极湛煌樟穴凛巧垒籍垣激亿昂嚼赘第5章植物细胞制药一第5章植物细胞制药一 第四节第四节 植物细胞培养基本技术 一、一、 植物材料的准备植物材料的准备 2、外植体的预处理、外植体的预处理 外植体的灭菌消毒处理外植体的灭菌消毒处理 根及地下贮藏器官的消毒处理：根及地下贮藏器官的消毒处理： 用自来水冲洗干净，用软毛刷刷洗；用自来水冲洗干净，用软毛刷刷洗； 用滤纸吸干后用纯酒精漂洗；用滤纸吸干后用纯酒精漂洗； 0.1%-0.2%升汞浸泡升汞浸泡5-10 min，或，或2%次氯酸钠浸泡次氯酸钠浸泡10-15 min； 无菌水洗无菌水洗3-4次。次。 砷瞄硝悠勺侩灸即丛稠嘛琢魏咕迹蒂局赁俄梢析睦鸵氏豁堕喊响犀耙芍迟第5章植物细胞制药一第5章植物细胞制药一 第四节第四节 植物细胞培养基本技术 一、一、 植物材料的准备植物材料的准备 2、外植体的预处理、外植体的预处理 外植体的灭菌消毒处理外植体的灭菌消毒处理 花药的消毒处理：花药的消毒处理： 发育适宜时期的花药被严密地包裹在花萼、花发育适宜时期的花药被严密地包裹在花萼、花瓣或颖片之中，属自然无菌状态；瓣或颖片之中，属自然无菌状态； 花蕾用花蕾用70酒精擦拭；酒精擦拭； 将花蕾浸泡在饱和漂白粉的上请液中将花蕾浸泡在饱和漂白粉的上请液中10 min； 无菌水冲洗无菌水冲洗 2-3 次；次； 小麦、水稻、玉米等的幼穗去掉外层苞片，小麦、水稻、玉米等的幼穗去掉外层苞片，70简单消毒后即可接种。简单消毒后即可接种。 灵岭者奔哉舱歼煞如毕颐酱诬窑蝎硬婿扎丑欺误裔撤毛瞄蒸刨挺炼敖稀渺第5章植物细胞制药一第5章植物细胞制药一 第四节第四节 植物细胞培养基本技术 二、培养基二、培养基 碳源：以蔗糖为主，具有叶绿体的细胞可以利用碳源：以蔗糖为主，具有叶绿体的细胞可以利用CO2； 氮源：硝态氮对植物细胞生长有利；氮源：硝态氮对植物细胞生长有利； 无机盐：在各种培养基中的大量元素和微量元素，以无机盐：在各种培养基中的大量元素和微量元素，以磷酸盐、硫酸盐和硝酸盐的形式提供；磷酸盐、硫酸盐和硝酸盐的形式提供； 生长因素：氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素、生长激素生长因素：氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素、生长激素 梭颓梧典非妄倪匆惰皮俘纱讹朋夜虚骏暗莽卷纱谁诣畦聪丹率肉褂棍岛淫第5章植物细胞制药一第5章植物细胞制药一 第四节第四节 植物细胞培养基本技术 二、培养基二、培养基 来源：不含或少含某些离子的重蒸水（双蒸来源：不含或少含某些离子的重蒸水（双蒸水）或去离子水。水）或去离子水。 目的：保持培养基成分完全人为控制。目的：保持培养基成分完全人为控制。 作用：起媒介作用作用：起媒介作用 组成作物体（占组成作物体（占757580%80%） 提供提供O O、H H元素元素 运输物质、调节渗透压运输物质、调节渗透压 1 1、水：培养基大部分是水、水：培养基大部分是水 躯翘属暴厘例谎角婚温措贱两做惺寺借坯订捶娄射陛厘革赡男徐绍甭渊蝴第5章植物细胞制药一第5章植物细胞制药一 第四节第四节 植物细胞培养基本技术 二、培养基二、培养基 大量元素：每升培养基含大量元素：每升培养基含 0.5 mM0.5 mM以上以上 微量元素：每升培养基含微量元素：每升培养基含 0.5 mM0.5 mM以下以下 大量元素：大量元素：O O、H H、N N、C C、P P、K K、MgMg、S S、CaCa 2 2、无机盐、大量元素、微量元素、无机盐、大量元素、微量元素 播梢秩钩恃应顿躁庸锡薪杨真河茬脚相数罪侮壬烃乳丧谈螺蓟惰割嵌碘钓第5章植物细胞制药一第5章植物细胞制药一 第四节第四节 植物细胞培养基本技术 二、培养基二、培养基 来源：硝态或氨态氮，或两者混用。来源：硝态或氨态氮，或两者混用。 作用：作用：N N吸收转化吸收转化氨基酸氨基酸蛋白质蛋白质 蛋白质主要组分是蛋白质主要组分是N N； 核酸含核酸含N N； 酶本身是蛋白质；酶本身是蛋白质； 细胞生长分化需细胞生长分化需N N； 2 2、无机盐、大量元素、微量元素、无机盐、大量元素、微量元素 N N 沸何争稀狞磕丘赴扯秧烩惭啮媳谎肾柬歇陌撮绿盗雨堵热调揖任羚郑顿听第5章植物细胞制药一第5章植物细胞制药一 第四节第四节 植物细胞培养基本技术 二、培养基二、培养基 2 2、无机盐、大量元素、微量元素、无机盐、大量元素、微量元素 来源：来源：NaH2PO4 或或 KH2PO4 作用：是植物体必需元素之一；作用：是植物体必需元素之一； 与蛋白质合成有关，缺磷蛋白质含量降；与蛋白质合成有关，缺磷蛋白质含量降； 高能磷酸键的化合物，供能高能磷酸键的化合物，供能ATP； 形成核蛋白、含形成核蛋白、含P化合物、核酸组分；化合物、核酸组分； 碳水化合物、蛋白质、脂肪合成、相互转化需磷。碳水化合物、蛋白质、脂肪合成、相互转化需磷。 P P 酵查豹束触绢棋孺蜕乞夸饼防疏辅锐萎叭唐叫纬享蛛凿档诲别芹俩氢瘤亭第5章植物细胞制药一第5章植物细胞制药一 第四节第四节 植物细胞培养基本技术 二、培养基二、培养基 2 2、无机盐、大量元素、微量元素、无机盐、大量元素、微量元素 MgMg、S S 来源：来源：MgSOMgSO4 4.7H.7H2 2O O满足硫镁的需要。满足硫镁的需要。 作用：镁是叶绿素组分；作用：镁是叶绿素组分； S S是蛋白质、氨基酸、酶的组分，缺是蛋白质、氨基酸、酶的组分，缺S S影响蛋白质合成、影响叶绿素形成。影响蛋白质合成、影响叶绿素形成。 料睬檀崩处床远捌历升萧婿拍棕熊拆络客绦左符牲颓舜膊幌荤河拾依溉耐第5章植物细胞制药一第5章植物细胞制药一 第四节第四节 植物细胞培养基本技术 二、培养基二、培养基 2 2、无机盐、大量元素、微量元素、无机盐、大量元素、微量元素 K K、CaCa K： 来源：来源：KCl、KNO3、KH2PO4 作用：酶促反应活化剂。作用：酶促反应活化剂。 Ca： 来源：来源：CaCl2 . H2O 或或 Ca(NO3)2 . 4H2O、 作用：影响酶的活性方向。作用：影响酶的活性方向。 决定新陈代谢的过程。决定新陈代谢的过程。 构造细胞壁，影响细胞分裂。构造细胞壁，影响细胞分裂。 赘瘫言术帚项吼翻岁袍咀其蔑险赊涕怜姿艘疽哪抛稚活揍适阴慈恕省瞳杭第5章植物细胞制药一第5章植物细胞制药一 第四节第四节 植物细胞培养基本技术 二、培养基二、培养基 2 2、无机盐、大量元素、微量元素、无机盐、大量元素、微量元素 Fe、Cu、Na Fe： 来源：来源：Na2EDTA螯合剂加螯合剂加FeSO4 . 7H2O和和乙二胺四乙酸二钠（乙二胺四乙酸二钠（EDTA） 螯合螯合铁，铁，pH 7.6-8.0。 作用：植物组织延长生长有作用。作用：植物组织延长生长有作用。 Cu：促离体根生长。促离体根生长。 Na：酶的组成成分，防叶绿素破坏。酶的组成成分，防叶绿素破坏。 祝开毅怜粒袋炳围泣趋昂杂闭厢伊锨锤区北趾幌梆袭库冠麻爬诲答簿早缉第5章植物细胞制药一第5章植物细胞制药一 第四节第四节 植物细胞培养基本技术 二、培养基二、培养基 MnMn：与植物呼吸作用、光合作用有关。与植物呼吸作用、光合作用有关。 B B：影响蛋白质合成。影响蛋白质合成。 注意注意: : 不同培养基无机盐浓度相差有的高达不同培养基无机盐浓度相差有的高达1010倍；倍； 高浓度无机盐保证组织生长需要的矿质营养，高浓度无机盐保证组织生长需要的矿质营养，使生长加快；使生长加快； 根要求无机盐浓度低些。根要求无机盐浓度低些。 2 2、无机盐、大量元素、微量元素、无机盐、大量元素、微量元素 Mn、B 光央里蹦敖尚害汪定路印谊竹胁摧疽拂仟假磺千投剃娄幢碉姬贩笑颜帮耗第5章植物细胞制药一第5章植物细胞制药一 无机盐的影响无机盐的影响 No MS salts 外植体没有任外植体没有任何再生迹象何再生迹象 MS salts reduced to 0.47 g/L 长出一些根，长出一些根，但芽不发育但芽不发育 MS salts increased to 9.52 g/L 外植体上表面发育外植体上表面发育出芽，但没有根和出芽，但没有根和愈伤组织。愈伤组织。 肢剂螺亲膝薯狠潮胯躇男宫兔悍五跨忻毁卢翘钦备滥植总豆尉邮映泉玖效第5章植物细胞制药一第5章植物细胞制药一 第四节第四节 植物细胞培养基本技术 二、培养基二、培养基 碳源碳源 来源：蔗糖、萄葡糖、果糖、麦芽糖、纤维二糖或来源：蔗糖、萄葡糖、果糖、麦芽糖、纤维二糖或多糖类的可溶性淀粉、糊精及果胶；多糖类的可溶性淀粉、糊精及果胶； 一般为一般为 2 23%3%的蔗糖。的蔗糖。 作用：维持培养基的合适渗透压；作用：维持培养基的合适渗透压； 构造植物体；构造植物体； 参与新陈代谢。参与新陈代谢。 注意：不同浓度影响细胞的增殖分化。注意：不同浓度影响细胞的增殖分化。 3 3、有机化合物、有机化合物 碳源、维生素、氨基酸、植物激素碳源、维生素、氨基酸、植物激素 树棒疚坦钝均曼塘咯邯片淄灭毯南扯忘俏鲸严嘱喘柱嘱煤袒充脑孕姥紊梧第5章植物细胞制药一第5章植物细胞制药一 蔗糖的影响蔗糖的影响 1 Growth medium is optimized for regeneration of plantlets 外植体上表面完全被绿色芽外植体上表面完全被绿色芽覆盖，下表面发育出根。覆盖，下表面发育出根。 No sucrose (0%) 外植体发育出稀少的芽，但外植体发育出稀少的芽，但没有生出根和愈伤组织。没有生出根和愈伤组织。 沫废慷纸鸿递榜旁异戏享担楼乞司鸵渡软臀欧磺笨球脓逐甥尚鱼庄崩诗声第5章植物细胞制药一第5章植物细胞制药一 蔗糖的影响蔗糖的影响 2 Sucrose reduced to 1% 外植体上表面边际芽发育出来，外植体上表面边际芽发育出来，也出现了一些根。也出现了一些根。 Sucrose increased to 5% 外植体表面覆盖发育的芽，外植体表面覆盖发育的芽，同时，下表面出现根。同时，下表面出现根。 壁秘瑰信涸漳享沦南宇书愚捧凶鲁遣熄畸岿逊惫拴蒲詹躺邪胳缓惋崩远炸第5章植物细胞制药一第5章植物细胞制药一 第四节第四节 植物细胞培养基本技术 二、培养基二、培养基 3 3、有机化合物、有机化合物 碳、维生素、氨基酸、植物激素碳、维生素、氨基酸、植物激素 维生素类维生素类： V V- -C C（抗坏血酸）：强还原能力，防组织氧化变褐。（抗坏血酸）：强还原能力，防组织氧化变褐。 V V- -B B1 1（硫胺素）：促愈伤组织产生，与愈伤组织活力有关。（硫胺素）：促愈伤组织产生，与愈伤组织活力有关。 V V- -B B2 2（烟酸或维生素（烟酸或维生素PPPP）：促代谢，促胚的发育，高浓度会抑）：促代谢，促胚的发育，高浓度会抑制生长。制生长。 V V- -B B6 6（吡哆醇）：促根生长。（吡哆醇）：促根生长。 肌醇（环己六醇）：无促进生长的作用，但有助活性物质发挥肌醇（环己六醇）：无促进生长的作用，但有助活性物质发挥作用。作用。 骤倾南缸兽掀畴尝踪遥壳贮校褂游届节措缘实阜脑绑幅亭竟觉酥羡晕亨吮第5章植物细胞制药一第5章植物细胞制药一 第四节第四节 植物细胞培养基本技术 二、培养基二、培养基 氨基酸氨基酸 来源：常用甘氨酸及多种氨基的混合来源：常用甘氨酸及多种氨基的混合水解酪蛋白，水解乳蛋白等。水解酪蛋白，水解乳蛋白等。 作用：是蛋白质的组分；促进器官增作用：是蛋白质的组分；促进器官增殖；可作有机氮源。殖；可作有机氮源。 3 3、有机化合物、有机化合物 碳、维生素、氨基酸、植物激素碳、维生素、氨基酸、植物激素 箭蔡始崇州挟匀主鸦像胆辽哉敖疾忠瓶工绣惶遮诲吃拭庶升宇卜跑奴浑陵第5章植物细胞制药一第5章植物细胞制药一 第四节第四节 植物细胞培养基本技术 二、培养基二、培养基 3 3、有机化合物、有机化合物 碳、维生素、氨基酸、植物激素碳、维生素、氨基酸、植物激素 植物激素植物激素：生长素生长素 吲哚乙酸（吲哚乙酸（IAAIAA）： 特性：天然生长素特性：天然生长素 作用：促离体组织生长、促进愈伤组织形成。作用：促离体组织生长、促进愈伤组织形成。 萘乙酸（萘乙酸（NAANAA）： 特性：人工合成的化学物质。特性：人工合成的化学物质。 作用：利发根，但根较细弱，作用：利发根，但根较细弱，IAA + IBA(IAA + IBA(吲哚丁酸吲哚丁酸) )处理使根生长健壮。处理使根生长健壮。 2,42,4- -D D（二氯苯氧乙酸（二氯苯氧乙酸）：）： 作用：促愈伤组织形成，诱导作用比作用：促愈伤组织形成，诱导作用比IAAIAA高高1010倍。抑倍。抑制器官、绿芽、根形成，特别是高浓度时抑制器官、绿芽、根形成，特别是高浓度时抑制作用更强。制作用更强。 思秦拂传袄匝香矫虞闪劈涉湖帽钒矾费彪支锋乙滓杂嘛槐篙旦逛署汲柳震第5章植物细胞制药一第5章植物细胞制药一 激素的影响激素的影响 NAA No NAA 少量芽发育，根不发育少量芽发育，根不发育 大量愈伤组织出现，少大量愈伤组织出现，少量芽发育，根不发育。量芽发育，根不发育。 NAA reduced to 0.1 mg/L 外植体上、下面发育大外植体上、下面发育大量根，芽很少，也有一量根，芽很少，也有一些愈伤组织出现。些愈伤组织出现。 NAA increased to 5.0 mg/L 堕胶收里迈芒专彦胚英沼皑豢但妄鉴拳凯凡跺闻犯榷椭百疏宾盂喂卓兰澄第5章植物细胞制药一第5章植物细胞制药一 第四节第四节 植物细胞培养基本技术 二、培养基二、培养基 3 3、有机化合物、有机化合物 碳、维生素、氨基酸、植物激素碳、维生素、氨基酸、植物激素 植物激素植物激素：细胞分裂素细胞分裂素 6-呋喃甲基腺嘌呤呋喃甲基腺嘌呤 (激动素、激动素、KT)：化学合成物质。：化学合成物质。 作用：广泛诱导芽的形成，诱导愈伤组织时，适量加作用：广泛诱导芽的形成，诱导愈伤组织时，适量加 KT 能改善器官发生状况。能改善器官发生状况。 6-苄基氨基嘌呤苄基氨基嘌呤 (6-BA)：人工合成：人工合成 作用：广泛诱导芽的形成，作用：广泛诱导芽的形成，BA效力比效力比 KT大。大。 玉米素玉米素 (ZT)：天然产物：天然产物 作用：对某些植物有特效。作用：对某些植物有特效。 腺嘌呤腺嘌呤 (AD)： 作用：诱导植物细胞分裂，对芽形成有促进作用。作用：诱导植物细胞分裂，对芽形成有促进作用。 窃鲤蒜牧陌拐剧楼钦钞荚俞归均奉纪笺失畜涌晨后世虎嚣万幅钉输撒阶掂第5章植物细胞制药一第5章植物细胞制药一 激素的影响激素的影响 BAP No BAP 大量根发育，少量芽生长；外植大量根发育，少量芽生长；外植体边缘出现未分化的愈伤组织。体边缘出现未分化的愈伤组织。 BAP reduced to 0.1 mg/L 根与芽的发育更加平衡，外植体根与芽的发育更加平衡，外植体边缘正在发育未分化的愈伤组织。边缘正在发育未分化的愈伤组织。 议狠撑逛赎猖弧磅寐蹈呈幻袍廓狐滋蹲濒耻云挞非冶娃算傈刘乔悯赐赚骡第5章植物细胞制药一第5章植物细胞制药一 植物组织和细胞培养物的生长过程植物组织和细胞培养物的生长过程主要取决于生长素和主要取决于生长素和分裂素的比例。分裂素的比例。 高浓度生长素和低浓度分裂素刺激细胞分裂；而低浓度高浓度生长素和低浓度分裂素刺激细胞分裂；而低浓度生长素和高浓度分裂素则刺激细胞生长。生长素和高浓度分裂素则刺激细胞生长。 极个别植物组织含有合成足够和量内源植物激素的能力；极个别植物组织含有合成足够和量内源植物激素的能力；绝大多数植物组织和细胞培养基加入一定量的植物生长绝大多数植物组织和细胞培养基加入一定量的植物生长调节剂。少数培养物在经历了多次继代培养后也可能自调节剂。少数培养物在经历了多次继代培养后也可能自发成长为激素自养型（不稳定表型），此类组织的优点发成长为激素自养型（不稳定表型），此类组织的优点是其生长率高和费用低。是其生长率高和费用低。 第四节第四节 植物细胞培养基本技术 二、培养基二、培养基 3 3、有机化合物、有机化合物 碳、维生素、氨基酸、植物激素碳、维生素、氨基酸、植物激素 献秀赚序羚纽候妹诣涝疲埠鬃坎乃镭葡杉兢苏釉裴居钝挎堑王电脑堂蛙烬第5章植物细胞制药一第5章植物细胞制药一 第四节第四节 植物细胞培养基本技术 二、培养基二、培养基 来源：从红藻等海藻中提取的高分子化合物来源：从红藻等海藻中提取的高分子化合物。 特性：特性：9090熔解熔解，4040以下凝固；过酸以下凝固；过酸、过碱或过碱或加高温会发生水解丧失凝固力加高温会发生水解丧失凝固力，存放过久存放过久会变褐丧失凝固力会变褐丧失凝固力。 用量：用量：琼脂琼脂 0 0. .6 6- -1 1. .0 0%，卡拉胶卡拉胶 0 0. .4 4- -0 0. .8 8%。 作用：凝固剂作用：凝固剂，固体培养时使液体培养基凝固固体培养时使液体培养基凝固。 4 4、琼脂琼脂 靳描勾帮仇省媚邮麻详掖疫倔响季泻吩旧逼砍丸掉弓涵苫喳阎船筹烂链拈第5章植物细胞制药一第5章植物细胞制药一 第四节第四节 植物细胞培养基本技术 二、培养基二、培养基 培养基母液的配制培养基母液的配制 1、大量元素、大量元素10倍母液：倍母液： 分别称取分别称取10倍量的硝酸铵、硝酸钾、磷酸二氢钾、倍量的硝酸铵、硝酸钾、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钙，分别溶解，按上述顺序混合，定硫酸镁、氯化钙，分别溶解，按上述顺序混合，定容至容至1000 ml；配制；配制1000 ml培养基取培养基取100 ml。 2、微量元素、微量元素100倍母液：倍母液： 分别称取分别称取1000倍量的硫酸锰、硫酸锌、硼酸、碘倍量的硫酸锰、硫酸锌、硼酸、碘化钾、硫酸铜、氯化钴、钼酸钠，分别溶解，按化钾、硫酸铜、氯化钴、钼酸钠，分别溶解，按上述顺序混合，定容至上述顺序混合，定容至100 ml；配制；配制1000 ml培养基培养基取取 1 ml。 芭轩蓖喀抠豹颤赖容钉礼鳞恋降注窝孤荫季幢羽品蘑铂莱碗餐景植撵挡材第5章植物细胞制药一第5章植物细胞制药一 第四节第四节 植物细胞培养基本技术 二、培养基二、培养基 3、铁盐、铁盐100倍母液倍母液 分别称取分别称取100倍的倍的FeSO3和和Na2EDTA ，分别溶解，然后，分别溶解，然后混合，定容至混合，定容至100 ml，配制，配制1000 ml培养基取培养基取10 ml。 4、维生素与氨基酸母液、维生素与氨基酸母液 培养基母液的配制培养基母液的配制 每种单独配制成每种单独配制成1mg/ml的的100 ml母液；母液； 氨基酸用量一般较高，可直接称取加入培养基；氨基酸用量一般较高，可直接称取加入培养基； 肌醇、酵母提取物、酪蛋白水解物等用量大，也肌醇、酵母提取物、酪蛋白水解物等用量大，也无需配制母液，直接称取加入培养基即可。无需配制母液，直接称取加入培养基即可。 岩忆痴咏琵对徊辞兜想狐麻奏赢屑扁铣俐读榜凰龚碱谊唱慎炕瘩波团淑梅第5章植物细胞制药一第5章植物细胞制药一 第四节第四节 植物细胞培养基本技术 二、培养基二、培养基 培养基母液的配制培养基母液的配制 5、植物激素母液、植物激素母液 单独称量，单独配制成单独称量，单独配制成0.12.0 mg/ml的母液；的母液； 生长素类先用少量生长素类先用少量0.1 M NaOH溶解，细胞分裂素需用溶解，细胞分裂素需用1 M HCl少许先行溶解，再稀释到所需浓度；少许先行溶解，再稀释到所需浓度； 赤霉素赤霉素(GA3)在水中不稳定，需用在水中不稳定，需用95酒精配制母液；酒精配制母液； 脱落酸脱落酸(ABA)需先少量丙酮助溶，然后加水溶解；需先少量丙酮助溶，然后加水溶解； 一般生长素浓度的使用为一般生长素浓度的使用为0.05-5mgL，细胞分裂素，细胞分裂素0.0510mgL。 账烯潍诡幅庙团掳勋蹭尸枷痴冤溶吩帧凋标包翼趟霞滇芍普岁穷祷暗矾刚第5章植物细胞制药一第5章植物细胞制药一 第四节第四节 植物细胞培养基本技术 二、培养基二、培养基 激素的配比模式激素的配比模式 无激素的培养基被称为无激素的培养基被称为基本培养基基本培养基。植物组织和细胞培。植物组织和细胞培养物的生长过程主要取决于生长素和细胞分裂素的比例：养物的生长过程主要取决于生长素和细胞分裂素的比例：形成愈伤组织、长根还是长芽。形成愈伤组织、长根还是长芽。 高高 有利于根和愈伤组织的形成有利于根和愈伤组织的形成 生长素生长素/ /细胞分裂素细胞分裂素 适中适中 有利于根芽的分化有利于根芽的分化 低低 有利于芽的形成有利于芽的形成 旺忆贺处穿茵框穗练楼耻巡辆丸想镶劝甜燎沥料沦枣梁谴销税矛脆基颐痪第5章植物细胞制药一第5章植物细胞制药一 第四节第四节 植物细胞培养基本技术 三、培养方法三、培养方法 植物细胞植物细胞/组织培养方法很多组织培养方法很多，其分类也不尽相同其分类也不尽相同。 及苟恶劲腥蓉陡横铀吨纂吧俗顽次法府荤某村验岛契振磊财枫嘉俄抛蹿钥第5章植物细胞制药一第5章植物细胞制药一 1. 固体培养固体培养 包括利用琼脂作为支技物的固体培养和固定化细包括利用琼脂作为支技物的固体培养和固定化细胞培养。胞培养。 特点：特点：简便易行、培养所占空间小简便易行、培养所占空间小 缺点：缺点：培养条件不均一，易堆积有害代谢物，难培养条件不均一，易堆积有害代谢物，难以控制和检测以控制和检测 常用固化剂：常用固化剂：琼脂琼脂、藻酸盐、角叉藻聚糖、藻酸盐、角叉藻聚糖、明胶明胶、羟乙基纤维素、聚丙烯酰胺、淀粉和硅胶等。羟乙基纤维素、聚丙烯酰胺、淀粉和硅胶等。 第四节第四节 植物细胞培养基本技术 三、培养方法三、培养方法 挂荆盅丰绞潭随译婶叫狸有秧轻梢榷异堡坯吁聊茶砖先砧斩慌蕴神府韵鳖第5章植物细胞制药一第5章植物细胞制药一 第四节第四节 植物细胞培养基本技术 三、培养方法三、培养方法 固体培养：用琼脂固体培养：用琼脂(0.6%-1.0%)、明胶明胶(10%)等做支持等做支持 物的固体培养因简便易行而被普遍使用物的固体培养因简便易行而被普遍使用。 液体培养：无凝固剂支持物的悬浮培养液体培养：无凝固剂支持物的悬浮培养。 控温控温：251 控光控光：有些植物材料在诱导愈伤组织阶段需要避光：有些植物材料在诱导愈伤组织阶段需要避光，但生长但生长、分化和再生都需光分化和再生都需光。用日光灯供光用日光灯供光，16 h/d。 外植体在培养外植体在培养3周左右必须更换到新鲜培养基中周左右必须更换到新鲜培养基中(继继代培养代培养)。 严爵填轰兹长同逆卑汪桥治又窟嚏著蕉障王太枚癸俭鸵教磋彤故朋篆霖岸第5章植物细胞制药一第5章植物细胞制药一 2. 液体培养液体培养 一种外植体经过一定次数的继代培养，待愈伤组织变一种外植体经过一定次数的继代培养，待愈伤组织变得较为疏松时，其培养物就可用于悬浮培养。得较为疏松时，其培养物就可用于悬浮培养。 液体培养系统包括小规模的悬浮培养和大规模的成批液体培养系统包括小规模的悬浮培养和大规模的成批培养、半连续和连续培养。悬浮培养可分为静止和振培养、半连续和连续培养。悬浮培养可分为静止和振荡两类。荡两类。 静止培养简便易行，而且不会出现营养物质浓度差的静止培养简便易行，而且不会出现营养物质浓度差的现象。现象。 振荡液体培养，是使悬浮细胞在液体培养基中，利用振荡液体培养，是使悬浮细胞在液体培养基中，利用磁力搅拌或摇床在不断振（摇）动的情况下进行培养，磁力搅拌或摇床在不断振（摇）动的情况下进行培养，此法可克服静止培养的许多缺点。此法可克服静止培养的许多缺点。 第四节第四节 植物细胞培养基本技术 三、培养方法三、培养方法 炉诵罚赚萝柯惮盯疡礁傻烦滋烛灾述浮警范骄漫极误蝗厅甲虹雀治拟箔刽第5章植物细胞制药一第5章植物细胞制药一 1.成批培养法成批培养法 将培养基一次性加入反应器中，接种、培养一将培养基一次性加入反应器中，接种、培养一定时间后收获细胞的操作方式称为成批培养法。定时间后收获细胞的操作方式称为成批培养法。 最适于植物细胞培养的生物反应器当属最适于植物细胞培养的生物反应器当属气升式气升式反应器反应器，它用通气代替搅拌，避免了使用机械，它用通气代替搅拌，避免了使用机械搅拌所致的细胞破碎、通气受限制、培养物易搅拌所致的细胞破碎、通气受限制、培养物易污染等缺点。污染等缺点。 植物细胞两步培养法：第一个反应器用于细胞植物细胞两步培养法：第一个反应器用于细胞生物量的累积，第二个反应器用于次级代谢产生物量的累积，第二个反应器用于次级代谢产物的生产。物的生产。（实例：紫草宁）（实例：紫草宁） 第四节第四节 植物细胞培养基本技术 三、培养方法三、培养方法 植物细胞大规模培养系统植物细胞大规模培养系统 治淡微掩摹陷鸳莲酚恩憨商阔封梯估稳痘桶梳滇补蛀锦迸挠准闰堰洼协域第5章植物细胞制药一第5章植物细胞制药一 2. 半连续培养法半连续培养法 在反应器中投料和接种培养一段时间后，在反应器中投料和接种培养一段时间后，将部分培养液和新鲜培养液进行交换的将部分培养液和新鲜培养液进行交换的培养方法称为半连续培养法。培养方法称为半连续培养法。 通过调整收获细胞的数量和次数来保持通过调整收获细胞的数量和次数来保持细胞重量的恒定细胞重量的恒定。 实例：实例：烟草细胞培养烟草细胞培养 第四节第四节 植物细胞培养基本技术 三、三、 培养方法培养方法 植物细胞大规模培养系统植物细胞大规模培养系统 嗡游园兢彝献澳盟渭士典舅屑璃粒尧洗囊绸尊巴市扭烟坊乙米胎橙僳徒丘第5章植物细胞制药一第5章植物细胞制药一 植物细胞悬浮培养反应器植物细胞悬浮培养反应器 （搅拌式）（搅拌式） 晴项狱决艰监拆砧曼盈读糯锰赁堵朵翼蚤孩谴喳搞氦锥螟惰浪斯缸饺配望第5章植物细胞制药一第5章植物细胞制药一 3. 连续培养法连续培养法 利用连续培养反应器，在投料和接种培养一段时间后，利用连续培养反应器，在投料和接种培养一段时间后，以一定速度连续采集细胞和培养液，并以同样速度供给以一定速度连续采集细胞和培养液，并以同样速度供给新鲜培养基以使细胞生长环境长期维持恒定的方法。新鲜培养基以使细胞生长环境长期维持恒定的方法。 =maxmax S /S /（K Ks s+S+S） 连续培养法培养时间长，其细胞的生产能力比较高，但连续培养法培养时间长，其细胞的生产能力比较高，但技术条件要求较为苛刻。技术条件要求较为苛刻。 在培养特定细胞或生产次级代谢产物时，又应用了二阶在培养特定细胞或生产次级代谢产物时，又应用了二阶段连续培养法段连续培养法第一罐投入生长培养基进行连续培养，第一罐投入生长培养基进行连续培养，第二罐第二罐投入生产培养基进行连续培养，两罐间连通管道投入生产培养基进行连续培养，两罐间连通管道连接。连接。 实例：实例：生物烟草细胞生物烟草细胞 第四节第四节 植物细胞培养基本技术 三、培养方法三、培养方法 植物细胞大规模培养系统植物细胞大规模培养系统 蓉蟹寨纳酷共碉账虏斗非既崔凄税什阜瘁圭剂梨句感茨婶樟菩铣慌导穷蔚第5章植物细胞制药一第5章植物细胞制药一 4. 固定化培养法固定化培养法 植物细胞固定化培养技术，可使细胞块中各个植物细胞固定化培养技术，可使细胞块中各个细胞处于一定理化梯度下，与完整植株类似，细胞处于一定理化梯度下，与完整植株类似，是目前相对优化的培养方法。是目前相对优化的培养方法。 固定化反应器：网状多孔板、尼龙网套、中孔固定化反应器：网状多孔板、尼龙网套、中孔纤维膜等。纤维膜等。 突出优点是细胞位置固定，易于获得高密度细突出优点是细胞位置固定，易于获得高密度细胞群体及维持细胞间物理化学梯度，利于细胞胞群体及维持细胞间物理化学梯度，利于细胞组织化，易于控制培养条件及获得较高含量的组织化，易于控制培养条件及获得较高含量的次级代谢产物。次级代谢产物。 实例：辣椒细胞固定化培养生产辣椒素。实例：辣椒细胞固定化培养生产辣椒素。 第四节第四节 植物细胞培养基本技术 三、三、 培养方法培养方法 植物细胞大规模培养系统植物细胞大规模培养系统 唉尊谈稿禹兴必岗挪彪缚茹瞒里娶呜庄坍诺逝识络死垛堆纹消邹凉领涯打第5章植物细胞制药一第5章植物细胞制药一