荧光定量PCR步骤【1224】

荧光定量PCR步骤一土壤基因组DNA提取（一）试剂和仪器：1. 乙醇(96%-100%)2. 异丙醇3. 离心机4. 漩涡振荡器5. 水浴锅6. 电子天平7. 超净工作台8. 1000ul、100ul移液枪；灭菌枪头9. 1.5ml灭菌离心管、2ml灭菌离心管10. 称量纸、称量勺、滤纸、酒精棉球、镊子等（二）提取步骤（OMEGA试剂盒 E.Z.N.A.TM Soil DNA Kit）：提取前准备工作：按说明书的比例用乙醇稀释SPW Wash Buffer。1. 打开水浴锅预热70（70预热Elution Buffer），用1.5ml离心管，取0.5g土壤，加入0.5g玻璃珠，加入1ml Buffer SLX MLus，立即在涡旋仪上最高速涡旋3min，使菌体进入溶液（豆粕的改为：打开水浴锅预热70，取3g豆粕到50mL离心管中，加入27mL水，3000rpm离心5min，重复3次各取4mL上清到5mL离心管，13000rpm离心2min，弃上清，加0.5g玻璃珠，加1mL Buffer SLX MLus，立即在涡旋仪上最高速涡旋3min，使菌体进入溶液）；2. 加入100ul Buffer DS，涡旋混匀；3. 转移至预热至70水浴锅中水浴10min，水浴过程中轻轻翻转一次（若存在较难溶解的细菌，水浴温度可增加到90），使菌体裂解；4. 3,000 rpm室温离心3min，转移800ul上清液到新的2ml离心管中，并加入270ul Buffer SP2涡旋混匀；（离心时准备冰盒）5. 置于冰中5min，13,000 xrpm、4离心5min（配平）；6. 在超净台中把上清液转称至新的2ml离心管中，加入0.7倍（749ul）的异丙醇，翻转混匀20-30次，把样品置于-20 1h；7. 13,000 rpm、4离心10min，沉淀DNA（可能看不到沉淀）；8. 倒弃上清液，并反扣于吸水纸上1min, 若还有残留，则在超净台中用移液器吸去；9. 加入70预热的200 ul Elution Buffer，涡旋10s，65水浴15min，让DNA充分溶解（如果想得到不含RNA的DNA，在这一步向样品中加10ul 25mg/mL的RNA酶A）；10. 用剪过的黄枪头加入50ul HTR Reagent(使用前充分摇匀)，漩涡混合10s;11. 置于室温2min，13,000 rpm离心2min, 使HTR Reagent沉降；12. 转移上清液至新的2ml离心管（若经HTR Reagent提取后样品仍然显棕色或深色，重复步骤10-12）；13. 加入与上清液等体积（约200ul）XP2 Buffer, 漩涡震荡充分混匀；14. 将上步所得溶液加到吸附柱（柱子套在2ml收集管中），12,000 rpm 室温离心1min，弃上清液，保留收集管；15. 柱子重新套在上步收集管中，加入300ul XP2 Buffer，12,000 rpm 室温离心1min，弃上清液和收集管；16. 柱子套在新的2ml收集管中，加入700ul SPW Wash Buffer（经乙醇稀释），12,000 rpm室温离心1min，弃上清液，保留收集管；17. 柱子重新套在上步收集管中，重复步骤16；18. 柱子重新套在上步收集管中，13,000 x g 室温空离2min，使吸附柱干燥（空离完后在超净台中开盖晾干2min。该步对去除乙醇残余至关重要，乙醇残留可能会影响下游酶的使用）；19. 把柱子置于新的1.5ml离心管，枪头不要碰触吸附柱，垂直悬空加加30ul Elution Buffer至吸附柱中央，65水浴15min， 13,000 x g离心1min，洗提回收DNA；20. 换个1.5ml离心管，重复上步（不需要水浴）；21. 将两次得到的DNA溶液合并后再分装两管，每个30ul，一个放4常用，另一个-20低温储存。22. 用微量之外分光光度计测定提取的DNA浓度，OD260/OD280约为1.8左右，过低有蛋白质和酚污染，过高有RNA存在。二琼脂糖凝胶电泳检测提取DNA产物（1%琼脂糖凝胶）（一）试剂和仪器1. EDTA、NaOH、Tris、乙酸2. EB3. 琼脂糖4. 10ul移液枪5. 电泳槽6. 电泳成像系统（二）药液配制1. 50TAE缓冲液（pH8.3）：称取Tris 242g，Na2EDTA2H2O 37.2g，向烧杯中加800ml的去离子水，充分搅拌溶解；加入57.1mL乙酸，使用去离子水定容至1L，高压灭菌后保存于室温。2. 1TAE缓冲液：例如需要使用200ml的1*TAE，则量4ml的50*TAE，196ml的去离子水，混匀即可。（三）步骤1. 制备1%琼脂糖凝胶（大胶用60ml,小胶用30ml）: 称取0.6g（0.3g）琼脂糖置于锥形瓶中,加入60ml（30ml）1TAE，该上盖子。微波炉加热煮沸，煮沸后转两圈取出摇匀，重复一次，至琼脂糖全部融化，摇匀。用水冷却锥形瓶至50-60，加入6ul（3ul）EB，摇匀，倒入内槽玻璃板上，使胶液缓慢展开，直到整个玻璃板表面形成均匀胶层，若有气泡需赶走气泡，插好梳子，室温下静置直至凝胶完全凝固（20min左右）。2. 垂直轻拔梳子，将凝胶及内槽放入电泳槽中。从负极（黑色）处添加 1TAE电泳缓冲液至没过胶板1-2mm为止。3. 加样: 用10 ul微量移液器在第一孔添加5ul Marker；取样品3ul，与2ul Loading buffer在点样板或PE手套上混合，用分别将样品加入凝胶槽内，每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。（注意：加样前要先记下加样的顺序）。4. 电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压120V，时间20min，n=1-1。样品由负极（黑色）向正极（红色）方向移动。5. 观察照相：在紫外灯下观察，DNA存在则显示出荧光条带，凝胶成像系统拍照保存。三、普通PCR扩增（一）耐药基因的特异性引物如表1如示（由北京奥科公司合成）表1耐药基因的引物序列目标基因引物引物序列（5-3）目标片段大小（bp）参考文献ermBermB-91fGATACCGTTTACGAAATTGG364Chen et al, (2007)ermB-454rGAATCGAGACTTGAGTGTGCermFermB-189fCGACACAGCTTTGGTTGAAC309Chen et al, (2007)ermB-497rGGACCTACCTCATAGACAAGermTermB-52fCATATAAATGAAATTTTGAG369Chen et al, (2007)ermB-420rACGATTTGTAT TAGCAACC（二）耐药基因的PCR扩增反应体系均为25L（表2），表2耐药基因的PCR扩增反应体系组分（L）ermBermFermT2Mix12.5012.5012.50上游引物（10M）0.500.500.5下游引物（10M）0.500.500.5DNA模板1.001.001.00灭菌超纯水10.5010.5010.50（三）各基因的PCR扩增反应条件如表3所示。表3耐药基因的PCR扩增反应程序步骤ermBermFermT1预变性94，240s94，240s94，240s2变性94，45s94，45s94，30s3复性（退火）58，45s56，45s49，30s4延伸72，45s72，45s72，45s5循环数（24步骤）（次）3535356再延伸72，360s72，360s72，360s7保存4，1h4，1h4，1h四琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物（2%琼脂糖凝胶）（一）试剂和仪器7. EDTA、NaOH、Tris、乙酸8. EB9. 琼脂糖10. 10ul移液枪11. 电泳槽12. 电泳成像系统（二）药液配制1. 50TAE缓冲液（pH8.3）：称取Tris 242g，Na2EDTA2H2O 37.2g，向烧杯中加800ml的去离子水，充分搅拌溶解；加入57.1mL乙酸，使用去离子水定容至1L，高压灭菌后保存于室温。2. 1TAE缓冲液：例如需要使用200ml的1*TAE，则量4ml的50*TAE，196ml的去离子水，混匀即可。（三）步骤6. 制备2%琼脂糖凝胶（大胶用60ml,小胶用30ml）：称取1.2g（0.6g）琼脂糖置于锥形瓶中，加入60ml（30ml）1TAE，该上盖子。微波炉加热煮沸，煮沸后转两圈取出摇匀，重复一次，至琼脂糖全部融化，摇匀。用水冷却锥形瓶至50-60，加入6ul（3ul）EB，摇匀，倒入内槽玻璃板上，使胶液缓慢展开，直到整个玻璃板表面形成均匀胶层，若有气泡需赶走气泡，插好梳子，室温下静置直至凝胶完全凝固（20min左右）。7. 垂直轻拔梳子，将凝胶及内槽放入电泳槽中。从负极（黑色）处添加 1TAE电泳缓冲液至没过胶板1-2mm为止。8. 加样: 用10 ul微量移液器在第一孔添加5ul Marker；取样品5ul用分别将样品加入凝胶槽内，每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。（注意：加样前要先记下加样的顺序）。9. 电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压120V，时间20min，n=1-1。样品由负极（黑色）向正极（红色）方向移动。10. 观察照相：在紫外灯下观察，DNA存在则显示出荧光条带，采用凝胶成像系统拍照保存。11. 若有目的条带则将PCR产物（剩余PCR产物20ul左右，上游引物10ul或上下游引物各10ul）送至北京奥科公司进行测序，根据测得的序列在NCBI上进行同源性比对，同源性应大于98%，判断是否为目的耐药基因。五胶回收（一）试剂和仪器：1.乙醇(96%-100%)3.离心机5.水浴锅8.移液枪；灭菌枪头9.1.5ml灭菌离心管、2ml灭菌离心管 （二）提取步骤（OMEGA试剂盒 E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit）： 提取前准备工作：A.按说明书的比例用乙醇稀释SPW Wash Buffer；B.调节水浴的温度为50-55；C.65预热的Elution Buffer。1. （普通PCR反映体系为25ul，需要两管，共50ul，插大梳子，用1.52的胶，将两管全打入一个孔）琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，推荐使用新鲜的TAE/ TBE Buffer和新配制的胶。2. 片段完全分离后，在紫外灯下迅速切取所需条带，DNA在紫外灯下爆光时间不超过30s，。 3. 切取下来的胶放入1.5ml的离心管，按照每1g凝胶加入1ml Binding Buffer（XP2）对应量，即胶与XP2以1:1体积混合（一般将凝胶全部淹没即可)，50-55水浴至凝胶完全溶解（约7min）。每隔2-3mi n翻转一次。注意: 当pH8，DNA会明显降解。当Binding Buffer完全溶解凝胶后,请注意溶液颜色的变化。如果溶液颜色已经变成紫色或红色，必须加入5ul 5M NaAc, pH5.2至溶液中调整pH值，溶液颜色变成浅黄色。4. 把HiBind DNA柱子套在提供的2ml收集管中。5. 降温后，把700ul溶好的胶加HiBind DNA柱子中(不要垂直冲柱子)，10,000 x g（12,000 rpm）室温离心1 min。6. 倒去滤液，把柱子装回收集管中，HiBind柱一次能装700ul溶液，若混合液超过700ul，每次转移700ul至柱子中，然后重复5-6步骤，直至胶加到完到柱子中。7. 把柱子重新装回收集管，加入300ul Binding Buffer（XP2）；10,000 x g（12,000 rpm）室温离心1 min。弃去滤液。8. 把柱子重新装回收集管，加入700ul SPW Wash Buffer（经乙醇稀释）；10,000 x g（12,000 rpm）室温离心1 min，弃去滤液。9. （可选）重复步骤8一次。10. 把柱子重新装回收集管，13,000 x g（13,000 rpm）空离柱子2min以甩干柱子基质。11. 把柱子装在新的1.5ml离心管上，加入15-30ul 65C预热的Elution Buffer到柱子基质上，室温静置1min；13,000 x g（13,000 rpm）室温离心1min，洗脱出DNA。六、LB培养基配制（一）LB液态培养基（配100ml，可做500个样，一般只需要称量、加水、灭菌）1称量用200ml烧杯按LB肉汤说明称量，加超纯水。2溶化在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。待药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。3调pH在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH值，如果pH偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH值，直至pH达7.6。反之，则用1mol/L HCl进行调节。注意pH值不要调过头，以避免回调，否则，将会影响培养基内各离子的浓度。对于有些要求pH值较精确的微生物，其pH的调节可用酸度计进行（使用方法，可参考有关说明书）。4分装按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内，本试验用250ml蓝盖大口瓶分装。分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。液体分装分装高度以瓶口高度的1/4左右为宜。5灭菌用记号笔注明培养基名称、组别、日期。将上述培养基以1.05kg/cm2（15磅/英寸2），121.3，20分钟高压蒸汽灭菌。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。6无菌检查将灭菌的培养基放入37的温室中培养2448小时，以检查灭菌是否彻底。4保存。（二）LA液态培养基（每100mL的LB中加100uL氨苄青霉素，配1L，可做62个样）1称量用1L烧杯按LB肉汤说明称量，加超纯水。2溶化在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。待药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。3调pH在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH值，如果pH偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH值，直至pH达7.6。反之，则用1mol/L HCl进行调节。注意pH值不要调过头，以避免回调，否则会影响培养基内各离子的浓度。对于有些要求pH值较精确的微生物，其pH的调节可用酸度计进行。4分装按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内，本试验用250ml蓝盖大口瓶分装。分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。液体分装分装高度以瓶口高度的1/4左右为宜。5灭菌用记号笔注明培养基名称、组别、日期。将上述培养基以1.05kg/cm2（15磅/英寸2），121.3，20分钟高压蒸汽灭菌。6. 抗生素的加入：高压灭菌后，将融化的LB培养基置于55的水浴中，待培养基温度降到55时（手可触摸）加入抗生素，以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。4保存。（三）LA固态培养基（配200mL，可做20个板左右）1称量用500ml烧杯按LB琼脂说明称量，加超纯水。2溶化在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。待药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。3调pH在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH值，如果pH偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH值，直至pH达7.6。反之，则用1mol/L HCl进行调节。注意pH值不要调过头，以避免回调，否则，将会影响培养基内各离子的浓度。对于有些要求pH值较精确的微生物，其pH的调节可用酸度计进行（使用方法，可参考有关说明书）。4分装按实验要求，可将配制的培养基分装入三角烧瓶内，分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。固体分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。5加塞培养基分装完毕后，在三角烧瓶口上塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。6包扎三角烧瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用时容易解开，同样用记号笔注明培养基名称、组别、日期。7灭菌用记号笔注明培养基名称、组别、日期。将上述培养基以1.05kg/cm2（15磅/英寸2），121.3，20分钟高压蒸汽灭菌。8. 抗生素的加入：高压灭菌后，将融化的LB培养基置于55的水浴中，待培养基温度降到55时（手可触摸）加入抗生素，以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。3.倒板：一般10ml倒1个板子。培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照10-15分钟。4.保存：用封口胶封边，并倒置放于4保存，一个月内使用。六、载体的连接与转化准备：1PMD18-T Vector载体试剂盒2E.coll Competent Cells DH5感受态细胞（-80保存，取出置于4冰种融化）3LB培养基 Day1晚上10点：（1）将纯化的PCR产物用于PMD18-T Vector载体的连接，连接体系为：1ul PMD18-T Vector，4ul PCR产物（模板），5ul Solution 。轻轻混匀，在PCR仪上16放置11h，4 forever，拿出时放在冰上；Day2中午12地点：（2）反应结束后，将连接产物全量（10 ul）螺旋加入至50 ul E.coll Competent Cells DH5感受态细胞中，注意须在感受态细胞刚刚解冻时螺旋加入连接产物，螺旋吹打混匀，冰中放置30min（开42水浴锅和37摇床）；（3）将加了连接产物的感受态细胞的离心管置于42的水浴中热激45s，后立即置于冰上2min，期间尽量不要摇动离心管；（4）往离心管里加200 ul的LB肉汤培养液（无氨苄霉素）。37，160r/min振荡培养45min。（5）在超净台上灼烧玻璃棒，取离心管的全量涂布到LA平板培养基（含有氨苄霉素）上养菌，37过夜培养16h（开始正放，3h后倒放培养皿）。Day3早上8点：七、重组子鉴定第2天挑选白色单个菌落于含980ul LA的肉汤培养液（含氨苄霉素）的1.5mL灭菌离心管中（用小的枪头挑菌，把枪头一并达到1.5ml离心管中，一个片段做6个管），220r/min摇菌大于3h，在超净台上把枪头打掉，取1ul菌液以原有的PCR引物对菌液进行扩增（一个片段6个），取5ul PCR产物用120V，2%琼脂糖凝胶电泳检测是否含有目的片段（作不加模板的阴性照），每个片段选取两个条带较亮的样所对应的200ul菌液送测序,确认目的基因。期间离心管放到37培养箱中继续摇菌，琼脂平板培养基放4冰箱保存。八、质粒的培养与提取阳性菌液以1:50扩摇（如：用10ml离心管，加5ml LA肉汤培养液，再加100ul阳性菌液），一管阳性菌液扩两管，37,220r/min摇菌16h。Day4早上9点：第2天看菌液是否浑浊，如果浑浊，则可用于后续质粒提取.提取质粒前取1ml菌液到1.5ml的灭菌离心管中进行保菌。质粒提取步骤参照OMEGA质粒提取试剂盒。质粒提取具体步骤为：（1）用上述10mL离心管所含菌液，12,000r/min离心5min，弃上清液；（2）加入250L RNase A与Solution的混合液（事先混合于4保存），漩涡剧烈振荡直至菌体完全重新悬浮。转移到2ml灭菌离心管中，室温静置1-2min；（3）加入250L Solution，轻轻地反复颠倒混匀5-6次，避免剧烈混匀。室温放置1-2min，使菌体充分裂解，直至形成澄清的裂解溶液，此步不能超过5min；（4）加入350L Solution，立即轻柔地反复颠倒5-6次,避免局部沉淀，此时会出现白色絮状沉淀，12,000r/m室温离心10min，收集上清液，迅速进行下步；（5）马上将上清液置于DNA纯化柱中12,000r/min离心1min，弃滤液；加入500L溶液HB，12,000r/min离心1min，弃滤液；（6）加入700L溶液SPW Wash Buffer，12,000r/min离心1min，弃滤液；重复本步骤1次；（7）13,000r/min空离3min，以除尽纯化柱中残留的液体，弃收集管；（8）将DNA纯化柱置于新的1.5mL的离心管中。向纯化柱中间处悬空滴加50L的灭菌去离子水，室温放置2min。12,000r/min离心1min，管底即为高纯度质粒DNA。质粒DNA于-20保存；（9）在琼脂糖上鉴定所提取出的质粒，用核酸定量仪记录质粒的浓度和260/280的比值，用于拷贝数的计算。九、荧光定量PCR反应1.标准曲线的制作将已知浓度的质粒DNA用灭菌超纯水进行10倍梯度稀释，稀释成八个梯度，使得PCR产物的浓度为原来浓度的10010-7，以稀释后的PCR产物为模板，按照定量PCR反应体系和反应条件进行PCR扩增，每个梯度3个重复，同时做3个阴性对照。拷贝数的计算：以Ct值为横坐标，不同浓度的样品拷贝数对数值为纵坐标，制成标准曲线每g质粒DNA基因拷贝数按以下公式计算（Whelan等，2003）：（式2.1）式中，L是阿弗加德罗常数（6.021023）；C是质粒DNA浓度（已测）；N是目标基因的模板长度（需要加上大肠杆菌的，若目标基因的为350，则需加上大肠杆菌的2992，bp）；M是每对DNA的平均分子量660 bp。根据实时荧光定量PCR的测定原理，以Ct值（Y）为横坐标，以起始拷贝数对数值（X）为纵坐标，数学模型为：Y = AX + B曲线的扩增效率公式为：E（%）=（101A 1）100 （式2.2）2.荧光定量PCR反应定量PCR反应体系为20L，具体为：10.0L THUNDERBIRD SYBR qPCR mix（避光保存），0.5L上游引物（10M），0.5L下游引物（10M），0.04L ROX染料（避光保存），1L DNA模板，7.96L H2O（8L）。（一般配100个孔的：1000L mix、800L 水、50L 上游引物、50L 下游引物、4L ROX，然后每个孔加1L DNA模板）定量PCR反应在带有7500 Software v2.0.5分析软件的ABI 7500荧光定量PCR仪上进行，具体的定量PCR反应程序见下表。表 耐药基因的荧光定量PCR反应程序步骤热循环程序1预变性95，2min2变性95，15s3退火60，30s4延伸72，30s5循环数（24步骤）（次）406溶解曲线默认（第二个温度与退火温度一致）注：溶解曲线程序：95，15s；60，1min；95，30s；60，15s。十、上机1. 选择Advanced Setup（选择第4个）2. Experiment-Properties2.1 命名2.2 7500（96 Wells）（默认）2.3 Quantitation-Standard Curve（默认）2.4 SYBR*Green Reagents（选择第2个）2.5 Standard（2 hours to complete a run）（默认）3. Plate Setup：选中96孔标为U（未知待测），选中Sample1，Define and Set Up Standards，分别填32、3、10000、1:10，Apply，Close。也可选中某些孔标为S（做标曲），其他的标为U。4. Run Method4.1 选择体系20L4.2 参考应该定量PCR反应程序5. Reaction Setup（默认）6. Materials List（默认）7. Run：START RUN