病毒转基因技术原理 概述

课 程 背 景l1980s, 转 基 因 技 术 随 分 子 克 隆 技 术 出 现l2003年 ， 我 国 SFDA批 准 了 全 球 第 一 种 基 因 治 疗 药 物 “ 今又 生 ” 上 市 。 （ State Food and Drug Administration）l2005年 ， 我 国 SFDA批 准 了 全 球 第 二 种 基 因 治 疗 药 物HB101上 市 。 （ 国 家 食 品 药 品 监 督 管 理 局 ）l2009年 12月 18日 出 版 的 Science 杂 志 将 ”return of gene therapy”作 为 年 度 重 大 的 科 学 突 破 之 一 。l2012年 12月 欧 盟 批 准 地 全 球 第 三 种 基 因 治 疗 药 物 上 市 。l迄 今 ， 多 达 1900种 基 因 治 疗 临 床 试 验 方 案 并 正 在 进 行 临 床试 验 。 转 基 因 技 术 正 成 为 分 子 医 学 的 一 种 革 命 性 的 技 术 手 段 ，并 已 成 为 治 疗 许 多 遗 传 性 和 获 得 性 疾 病 的 潜 在 希 望 所 在 。 问 题l社 会 公 众 对 健 康 需 求 的 增 加l生 命 科 学 和 医 学 研 究 的 推 动l对 转 基 因 技 术 的 安 全 和 伦 理 关 注 持 续 增 加 。 课 程 内 容l分 为 理 论 课 与 实 践 课l转 基 因 技 术 概 述l病 毒 转 基 因 技 术 原 理 、 纯 化 制 备 技 术 和 医 学 应 用l生 物 安 全l医 学 伦 理 问 题l表 达 外 源 基 因 的 复 制 缺 陷 型 重 组 腺 病 毒 的 构 建 和 鉴 定DNA病 毒RNA病 毒杂 合 病 毒 第 一 章 转 基 因 技 术 概 述 范雄林86-27-华中科技大学同济医学院病原生物学系研究生高水平课程病毒转基因技术原理 主 要 内 容l基 因 转 移 方 式l真 核 细 胞 的 转 基 因 技 术l外 源 基 因 表 达 读 框 的 构 建 原 理 1. 定 义l基 因 转 移 （ gene transfer） : 自 然 发 生l转 基 因 技 术 (transgene technology): 人 工 利 用 2. 常 见 的 基 因 转 移 方 式l转 化 (transformation)l转 导 (transduction )l转 染 (transfection) 现 象 定 义分 类用 途 l转 化 （ transformation ）u现 象 : 肺 炎 链 球 菌 的 转 化 试 验u定 义 :u分 类 和 应 用 :自 然 转 化 :感 受 态 ,宿 主 菌 种 类 人 工 转 化 : 低 温 CaCl2、 电 穿 孔 小 鼠 的 肺 炎 链 球 菌 的 转 化 试 验 l转 导 (transduction )u现 象 :“ U” 型 管 实 验 u定 义 :u分 类 和 应 用 :普 遍 性 转 导 局 限 性 转 导 局 限 性 转 导 l转 染 (transfection)u现 象 : 感 染 (infection)、 病 毒 感 染u定 义 : 广 义 和 狭 义u分 类 和 应 用 :物 理 化 学 方 法 生 物 学 方 法 (病 毒 载 体 ) 野 生 型 病 毒 的 自 然 感 染 、 病 毒 载 体 转 染 和 质 粒 经 化 学 法 介 导 的 转 染 3. 基 因 转 移 入 真 核 细 胞 的 方 法l基 因 转 移 入 真 核 细 胞 的 影 响 因 素 l外 源 基 因 转 移 入 真 核 细 胞 的 类 型和 方 法 l构 建 外 源 基 因 的 基 本 要 素 转 移 入 原 核 细 胞 的 影 响 因 素 :u限 制 -修 饰 系 统u质 粒 宿 主 范 围 和 相 容 性u同 源 重 组 与 非 同 源 重 组l基 因 转 移 入 真 核 细 胞 的 影 响 因 素 真 核 与 原 核 细 胞 具 有 显 著 区 别 ;外 源 基 因 要 进 入 真 核 细 胞 ， 要 突 破 三 大 障 碍 ; 理 想 的 转 基 因 技 术 方 法 质 粒 型 载 体 :l物 理 方 法l化 学 方 法l外 源 基 因 转 移 入 真 核 细 胞 的 类 型 和 方 法l传 统 的 针 头 注 射l显 微 注 射l粒 子 轰 击l电 穿 孔l流 体 动 力 学l包 裹 微 球l超 声l磷 酸 钙 法l脂 质 体 法lDEAE-Dxtran法 常 用 的 物 理 方 法 介 导 基 因 转 移物 理 方 法 原 理 材 料 DNA用 量 优 点 缺 点传 统 的 针 头注 射 外 力 注 射 器 高 便 宜 、 简 单 、 便于 应 用 于 临 床 效 率 比 较 低显 微 注 射 细 胞 内 注 射 DNA 显 微 镜 和 显 微注 射 针 低 适 用 于 细 胞 水 平的 研 究 ， 不 易 降解 步 骤 繁 琐 ， 不 适用 于 临 床 ， 专 业技 术 要 求 高粒 子 轰 击 高 压 气 体 使 微 小的 载 体 加 速 不 同 的 加 速 装置 低 对 靶 组 织 有 很 高的 效 率 需 要 很 多 的 设 备和 步 骤 电 穿 孔 电 脉 冲 电 穿 孔 仪 低 高 转 染 效 率 未 得 到 广 泛 认 可流 体 动 力 学 流 体 动 力 学 的 力量 特 殊 的 注 射 器 中 等 简 单 易 于 使 用 、转 染 效 率 高 组 织 局 限 性包 裹 微 球 胶 囊 化 的 微 球 包裹 DNA 中 等 控 制 下 投 递 和 释放 制 备 的 质 量 控 制超 声 超 声 仪 超 声 超 声 仪 中 等 偏 低 安 全 、 组 织 损 伤小 技 术 不 断 发 展 、经 验 有 限 l外 源 基 因 转 移 入 真 核 细 胞 的 类 型 和 方 法病 毒 颗 粒 型 载 体 (病 毒 介 导 的 转 基 因 技 术 ) u假 型 病 毒 载 体 （ 复 制 缺 陷 性 病 毒 载 体 ） ： 具 有 感 染 性u重 组 型 病 毒 载 体 ： 具 有 感 染 性lDNA病 毒 载 体 ： AdV, AAV,HSV-1,etc.lRNA病 毒 载 体 : HIV, etc.l杂 合 型 病 毒 载 体 分 类 DNA病 毒 载 体 RNA病 毒 载 体腺 病 毒 载 体 腺 相 关 病 毒载 体 单 纯 疱 疹 病毒 载 体 痘 苗 病 毒 载体 杆 状 病 毒 载体 鼠 白 血 病 病毒 载 体 慢 病 毒 载 体 甲 病 毒 载 体 仙 台 病 毒 载体优 点 外 源 基 因容 量 大 (6-36kb);不整 合 到 宿主 染 色 体中 ， 安 全性 高 ； 宿主 范 围 广泛 ， 可 感 染 包 括 分裂 期 和 静止 期 细 胞在 内 的 不同 类 型 的人 和 多 种哺 乳 动 物细 胞 ； 易于 制 备 和纯 化 ,病 毒滴 度 高 达 10 9 pfu/ml 外 源 基 因 可整 合 到 人 细胞 基 因 组 中实 现 长 期 稳定 表 达 ； 可感 染 包 括 非分 裂 期 细 胞在 内 的 多 种细 胞 ； 载 体的 免 疫 原 性和 毒 性 低 ，无 致 病 性 ，安 全 性 好 ；病 毒 滴 度 高达 10 10pfu ml， 易于 制 备 和 纯化 载 体 容 量 大(30kb 50kb),并可 同 时 表 达多 基 因 ； 不能 整 合 到 细胞 基 因 组 中 ；宿 主 范 围 广 ，包 括 大 量 哺乳 动 物 和 鸟类 的 分 裂 细胞 和 非 分 裂细 胞 ， 对 神经 系 统 有 天然 的 亲 嗜 性 ，并 能 在 神 经 元 细 胞 中 建立 长 期 稳 定的 隐 性 感 染 载 体 容 量 大（25kb40kb） ， 并 可同 时 表 达 多基 因 ； 宿 主范 围 广 ， 能感 染 几 乎 所有 哺 乳 动 物细 胞 ； 不 会整 合 到 宿 主细 胞 基 因 组中 ， 安 全 性好 载 体 容 量 大(38 kb)， 并可 同 时 表 达多 基 因 ； 只能 感 染 昆 虫宿 主 ， 在 人体 细 胞 内 不能 复 制 ， 生物 安 全 性 高且 无 细 胞 毒性 ； 外 源 蛋白 的 表 达 水平 高 达 到 细胞 总 蛋 白 的50 插 入 外 源基 因 的 容量 相 对 较大 (10kb)；能 够 有 效整 合 到 靶细 胞 的 基因 组 中 ；感 染 细 胞种 类 广 泛 ，效 率 高 ；病 毒 滴 度较 高 (10 6-107pfuml) 可 将 外 源 基因 有 效 地 整合 人 宿 主 细胞 染 色 体 上 ；长 期 稳 定 的表 达 ； 可 有效 地 感 染 受精 卵 、 神 经元 细 胞 、 干细 胞 等 多 种类 型 的 细 胞 ；对 分 裂 期 和非 分 裂 期 细胞 均 能 感 染 ；不 易 诱 发 宿主 免 疫 反 应 不 易 与 宿 主基 因 组 整 合 ；宿 主 范 围 广谱 ， 感 染 哺乳 动 物 及 非哺 乳 动 物 的细 胞 系 、 原代 细 胞 培 养物 、 嗜 神 经元 特 性 ； 机体 对 甲 病 毒载 体 自 身 的免 疫 反 应 较低 不 会 与 宿 主DNA发 生 整合 ， 安 全 性高 ； 宿 主 细胞 广 ； 可 在多 种 细 胞 内获 得 较 强 的基 因 表 达 缺 点 潜 在 产 生复 制 能 力的 腺 病 毒 ；缺 乏 靶 向性 ； 基 因表 达 时 间短 ； 宿 主对 载 体 的免 疫 反 应较 强 载 体 的 容 量相 对 较 小(4.5kb)；与 宿 主 染 色的 整 合 是 一种 随 机 整 合 仅 能 瞬 时 表达 ； 细 胞 毒性 免 疫 反 应 弱 ；病 毒 用 量 大 ；制 备 病 毒 的滴 度 低 表 达 产 物 的纯 化 困 难 随 机 性 的整 合 会 造成 表 达 的不 确 定 性和 潜 在 致瘤 危 险 性 潜 在 的 生 物安 全 性 和 遗传 毒 性 转 染 效 率 比较 低 、 甲 病毒 RNA载 体的 稳 定 性 差 、细 胞 毒 性 、仅 能 在 体 内瞬 时 表 达 包 装 容 量 小(3.4kb)；细 胞 融 合 毒性 ； 宿 主 对载 体 的 免 疫反 应 较 强 不 同 类 型 转 基 因 技 术 方 法 的 优 缺 点 比 较转基因技术方法 优点 缺点生物学方法（病毒载体介导法） 转染效率高 复杂的生产程序适合全身应用 产品的高质量控制具有靶向组织细胞能力 高成本机体预存在的免疫力可以干扰载体低温保存安全问题化学方法 易转染培养细胞 难以生产稳定产品 生产简单 临床应用少易保存基因大小不受限物理方法 基因大小不受限 需要特殊设备常ex vivo应用，局部应用高效非特定细胞型操作程序易标准化 l构 建 外 源 基 因 的 基 本 要 素 u转 录 控 制 元 件u翻 译 控 制 元 件u病 毒 复 制 包 装 信 号 复 习 思 考 题l影 响 外 源 基 因 进 入 真 核 细 胞 的 因 素 。l物 理 、 化 学 和 病 毒 载 体 转 基 因 技 术 的 优 缺点 比 较 。l不 同 病 毒 载 体 转 基 因 技 术 的 优 缺 点 比 较 。l外 源 基 因 表 达 读 框 的 构 建 原 理 。