53课题3血红蛋白的提取和分离（共36张PPT）

下 面 请 看 一 条 新 闻 英 国 自 然 杂 志 登 论 文 说 ， “ ” 蛋 白 质 可 有 效 抑 制 艾 滋 病 病 毒 的 感 染 。 此 后 ， 世 界 各 地 的 很 多 科 学 家 开 始 研 究“ ” 蛋 白 质 的 结 构 ， 但 到 目 前 为 止尚 未 有 人 宣 称 取 得 突 破 性 进 展 。 提 问研 究 “ TRIM5” 蛋 白 质 的 第 一 步 是 什 么 ？分 离 和 提 纯 TRIM5蛋 白 质 。回 答 根 据 蛋 白 质 各 种 特 性 的 差 异 ， 如 分 子的 形 状 和 大 小 、 所 带 电 荷 的 性 质 和 多 少 、溶 解 度 、 吸 附 的 性 质 、 对 其 他 分 子 的 亲 和力 等 等 ， 可 以 用 来 分 离 不 同 蛋 白 质 。 1、 凝 胶 色 谱 法 凝 胶 色 谱 法 也 称 为 分 配 色 谱 法 ， 它 是 根据 分 子 量 的 大 小 分 离 蛋 白 质 的 方 法 之 一 ， 又称 分 子 筛 层 析 。 凝 胶 实 际 上 是 一 些 微 小 的 多 孔 球 体 ， 例如 ： 浮 石 、 琼 脂 、 琼 脂 糖 、 聚 乙 烯 醇 、 聚 丙烯 酰 胺 、 葡 聚 糖 凝 胶 等 一 、 基 本 概 念 及 原 理 原 理 ： 凝 胶 色 谱 法 中 所 用 到 的 凝 胶 为多 糖 类 化 合 物 构 成 的 多 孔 球 体 ， 小球 体 的 内 部 有 许 多 贯 穿 的 通 道 。不 同 相 对 分 子 质 量 的 蛋 白 质 因 此 得 以 分 离 。小 分 子 穿 过 多 孔 凝 胶 颗 粒 的 内 部 ， 路 程 长 ， 流 动 慢 ； 大 分 子 通 过 多 孔 凝 胶 颗 粒 的 间 隙 ， 路 程 短 ， 流 动 快 。 洗 脱 ： 从 色 谱 柱 上 端 不 断 注 入 缓 冲 溶 液 （ 洗 脱 剂 ） ， 促 使 蛋 白 质 分 子 的 差 速 流 动 。混 合 物上 柱 洗脱 大 分 子 流 动 快小 分 子 流 动 慢 收 集大 分 子 收 集小 分 子 在 一 定 范 围 内 ， 能 够 抵 制 对 溶液 PH值 的 影 响 ， 维 持 PH 不 变 。 通 常 由 溶 解 于 水 中 配 制 而 成 。调 节 缓 冲 剂 的 就 可 以 制 得 在 使用 的 缓 冲 液 。 , 利 用 缓 冲 液 模 拟 细 胞 内 的 PH环 境 ， 保 证 血 红 蛋 白 的 正 常 结 构 和 功 能 ， 便 于 观 察 ( )和 科 学 研 究 ( ) 磷 酸 缓 冲 液外 界 的 酸 和 碱基 本12 种 缓 冲 剂使 用 比 例 不 同 PH范 围 内 思考：说出人体血液中缓冲对。 NaH 2PO4 / Na2H PO4H 2CO3 / NaH CO3 带 电 粒 子 在 作 用 下 发 生 的 过 程 。 许 多 重 要 的 生 物 大 分 子 ， 如 多 肽 、 核 酸 等 都具 有 的 基 团 ， 在 一 定 的 PH下 ， 这 些 基 团 会 带上 或 。 在 电 场 的 作 用 下 ， 这 些 带 电 分 子会 向 着 的 的 电 极 移 动 。 电 泳 利 用了 待 分 离 样 品 中 各 种 分 子 以 及 分 子本 身 的 、 的 不 同 ， 使 带 电 分 子 产 生 不 同的 ， 从 而 实 现 样 品 中 各 种 分 子 的 分 离 。琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 、 聚 丙 稀 酰 胺 凝 胶 电 泳 。电 场 迁 移可 解 离正 电 负 电与 其 所 带 电 荷 相 反 带 电 性 质 的 差 异大 小 形 状迁 移 速 度 最 常 用 的 电 泳 支 持 介 质 是 聚 丙 烯 酰 胺 和 琼脂 糖 凝 胶 。 琼 脂 糖 有 一 个 相 对 较 大 的 孔 径 ， 用来 分 离 大 分 子 例 如 核 酸 、 大 蛋 白 和 蛋 白 复 合 物 ，聚 丙 烯 酰 胺 形 成 孔 径 较 小 的 胶 ， 适 合 于 分 离 大多 数 蛋 白 和 小 片 段 核 酸 。聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 （ PAGE） （ 1） 、 蛋 白 质 在 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 中 的 迁 移 率 取 决 于 等 因 素 。它 所 带 静 电 荷 的 多 少 以 及 分 子 的 大 小（ 2） 、 SDS能 与 各 种 蛋 白 质 形 成 蛋 白 质 -SDS复 合 物 ，SDS所 带 负 电 荷 的 量 大 大 超 过 了 蛋 白 质 分 子 原 有 电 荷量 。 因 而 掩 盖 了 不 同 种 蛋 白 质 间 的 电 荷 差 别 ， 使 电 泳迁 移 率 完 全 取 决 于 （ ） 。分 子 的 大 小SDS聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 （ SDS-PAGE） 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 操 作 简 单 ， 电 泳 速 度 快 ， 样 品 不 需 要 事 先处 理 ； 电 泳 后 区 带 易 染 色 ， 样 品 极 易 洗 脱 ， 便 于 定 量 测 定 。 测 定 蛋 白 质 的 相 对 分 子 质 量 常 用 SDS-聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 ，这 是 因 为 该 方 法 分 离 蛋 白 质 完 全 取 决 于 分 子 的 大 小 ， 而 非 所带 电 荷 的 性 质 和 分 子 的 大 小 、 形 状 。 1.样 品 处 理 2.粗 分 离 3.纯 化 4.纯 度 鉴 定 本 课 题 我 们 以 哺 乳 动 物 红 细 胞 为 材 料 ， 学习 初 步 分 离 血 红 蛋 白 的 方 法 。二 、 实 验 操 作 血 液 由 _和 _两 部 分 组 成 ， 其 中_最 多 。 在 红 细 胞 的 组 成 中 ， 除 水 以 外 ， 约90%是 _ 。 血 红 蛋 白 由 4条 肽 链 组 成 ， 包 括_和 _构 成 的 ， 其 中 每 条 肽链 环 绕 一 个 _基 团 ， 此 基 团 可 携 带 一 分 子O2或 一 分 子 CO2。 血 红 蛋 白 因 含 有 _而 呈 _ 。介 绍 ： 血 液 组 成 成 分血 浆 血 细 胞红 细 胞血 红 蛋 白2条 -肽 链 2条 -肽 链 亚 铁 血 红 素 本 课 题 可 选 用 猪 、 牛 、羊 或 其 他 哺 乳 动 物 的 血 液 来分 离 血 红 蛋 白 。血 红 素 红 色 血 液100mL3g柠 檬 酸 钠 低 速 离 心2 min 红 细 胞血 浆 吸 出 血 浆 5倍 体 积 生 理 盐 水红 细 胞缓 慢 搅 拌 10min 1.样 品 处 理 ： 红 细 胞 的 洗 涤 、 血 红 蛋 白 的 释 放 低 速 短 时 离 心 ： 防 止 白 细 胞 沉 淀缓 慢 搅 拌 ： 防 止 红 细 胞 破 裂 血 液100mL3g柠 檬 酸 钠 低 速 离 心2 min 红 细 胞血 浆 吸 出 血 浆 5倍 体 积 生 理 盐 水红 细 胞缓 慢 搅 拌 10min重 复 洗 涤 3次 ， 直 至 上 清 液 没 有 黄 色 ， 表 明 红 细 胞 已 洗 涤 干 净 。 洗 涤 好 的 红 细 胞 中 加 入 蒸 馏 水 和 40%的 甲 苯后 ， 置 于 磁 力 搅 拌 器 上 充 分 搅 拌 10min， 红 细 胞破 裂 ， 血 红 蛋 白 释 放 出 来 。a.蒸 馏 水 的 作 用 是 :b.加 入 甲 苯 的 作 用 是 :c.充 分 搅 拌 的 目 的 是 : 使 红 细 胞 大 量 吸 水 胀 裂溶 解 红 细 胞 的 细 胞 膜加 速 红 细 胞 的 破 裂 滤 纸过 滤脂 类 物 质混 合 液高 速 离 心10min 离 心 管 烧 杯 有 机 溶 剂血 红 蛋 白2.粗 分 离 20mmol/L磷 酸 缓 冲 液1mL 1mL2.粗 分 离 凝 胶 色 谱 柱 的 制 作 凝 胶 色 谱 柱 的 装 填 样 品 的 加 入 和 洗 脱通 过 凝 胶 色 谱 法 分 离 相 对 分 子 质 量 不 同 的 蛋 白 质 。 纯 度 鉴 定 凝 胶 色 谱 柱 的 制 作3.纯 化 凝 胶 色 谱 柱 的 装 填3.纯 化 步 骤 操 作 要 求12345 立 刻 用 磷 酸 缓 冲 液 洗 涤 平 衡 12h洗 涤 平 衡 一 次 性 缓 慢 倒 入 ； 轻 轻 敲 打装 填 悬 浮 液 凝 胶 颗 粒 蒸 馏 水 充 分 溶 胀根 据 色 谱 柱 体 积 计 算 凝 胶 用 量色 谱 柱 垂 直 固 定 在 支 架 上配 制 悬 浮 液计 算 称 量 凝 胶固 定 色 谱 柱注 意 ： 色 谱 柱 内 不 能 有 气 泡 ； 装 完 后 ， 立 即 用 缓 冲 液 洗 涤 ， 平 衡 凝 胶 ， 使 凝 胶 装 填 紧 密 如 果 红 色 区 带 均 匀 一 致 地 移 动 ， 说 明 色 谱 柱 制 作 成 功 1.调 液 面 2.加 样 3.再 调 液 面 4.洗 脱 5.收 集 样 品 的 加 入 和 洗 脱缓 冲 液凝 胶 纯 度 鉴 定 方 法 ： SDS聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 鉴 定 注 意 事 项1.红 细 胞 的 洗 涤 ： 洗 涤 次 数 不 能 过 少 ； 低 速 、 短 时 离 心 。2.色 谱 柱 的 装 填 ： 装 填 尽 量 紧 密 ， 降 低 颗 粒 间 隙 ； 无 气 泡 ； 洗 脱 液 不 能 断 流 。3. 凝 胶 的 预 处 理 ： 沸 水 浴 法 时 间 短 ， 还 能 除 去 微 生 物 和 气 泡4. 色 谱 柱 成 功 标 志 ： 红 色 区 带 均 匀 一 致 地 移 动 。 1.样 品 处 理 2.粗 分 离 3.纯 化 红 细 胞 的 洗 涤 血 红 蛋 白 的 释 放 分 离 血 红 蛋 白 溶 液 透 析凝 胶 色 谱 法SDS-聚 丙 烯 酰 氨 凝 胶 电 泳4.纯 度 鉴 定 一 、 蛋 白 质 提 取 和 分 离 原 理 二 、 蛋 白 质 提 取 和 分 离 的 方 法 1） 凝 胶 色 谱 法 ： 又 称 分 配 色 谱 法 2） 电 泳 法三 、 蛋 白 质 提 取 和 分 离 在 缓 冲 液 中 进 行四 、 蛋 白 质 提 取 和 分 离 的 实 验 流 程步 骤 ： 样 品 处 理 、 粗 分 离 、 纯 化 、 纯 度 鉴 定（ 凝 胶 色 谱 法 ） （ 电 泳 法 ） 1.相 对 分 子 质 量 不 同 的 蛋 白 质 在 凝 胶 中 的 进 行 过 程 可 表 示 为 图 中 哪 一 个 ：2.用 凝 胶 色 谱 法 分 离 蛋 白 质 时 ， 分 子 量 大 的 蛋 白 质 ： A 路 程 较 长 ， 移 动 速 度 较 慢 B 路 程 较 长 ， 移 动 速 度 较 快 C 路 程 较 短 ， 移 动 速 度 较 慢 D 路 程 较 短 ， 移 动 速 度 较 快 D 3、 一 分 子 血 红 蛋 白 最 多 可 携 带 的 O2分 子 数 和 CO2分 子 数 分 别 是 （ ）A 4、 2 B 4、 4 C 2、 1 D、 1、 1B4.洗 涤 红 细 胞 时 ， 离 心 所 用 方 法 为 ： A.低 速 长 时 间 离 心 B.低 速 短 时 间 离 心 C.高 速 长 时 间 离 心 D.高 速 短 时 间 离 心B5.下 列 是 有 关 血 红 蛋 白 提 取 和 分 离 的 相 关 操 作 ， 其 中 正确 的 是 ： A 可 采 集 猪 血 作 为 实 验 材 料 B 用 蒸 馏 水 重 复 洗 涤 红 细 胞 C 血 红 蛋 白 释 放 后 应 低 速 短 时 间 离 心 D 洗 脱 液 接 近 色 谱 柱 底 端 时 开 始 收 集 流 出 液 A