分子流行病学全套PPT课件

分 子 流 行 病 学Molecular Epidemiology 1 第 一 节 概 述 第 二 节 主 要 研 究 内 容 第 三 节 研 究 实 例 2 分 子 流 行 病 学 产 生 的 背 景 疾 病 防 治 使 流 行 病 学 遇 到 了 一 些 新 的 挑 战 传 染 病 防 治 发 现 病 原 体 耐 药 性 和 变 异 (流 感 疫 苗 ) 病 原 生 物 的 多 样 性 (H5N1) 慢 性 非 传 染 病 复 杂 性 状 疾 病 的 病 因 学 问 题 : 基 因 -环 境 交 互 作 用 3 分 子 生 物 学 理 论 和 技 术 的 飞 速 发 展 1953 - Discovery of DNA double helix (Crick fast public data release http:/www.hapmap.org 6 分 子 流 行 病 学 的 发 展 历 程 国 外 ： 1972年 -提 出 “ 流 感 分 子 流 行 病 学 ” 1993年 ： 美 国 Schulte出 版 了 世 界 上 第 一 本 分 子 流 行 病 学 专著 分 子 流 行 病 学 -原 理 和 实 践 (Molecular Epidemiology: Principles and Practice)。 1996年 国 际 流 行 病 学 学 术 会 议 ： 狭 义 分 子 流 行 病 学 是 测 量作 为 暴 露 或 效 应 的 生 物 标 志 信 息 大 分 子 ： DNA、 RNA和 蛋 白 质 。 从 广 义 上 包 括 任 何 实 验 的 、 生 化 的 测 量 。 7 Numbers of Papers with Subject Words “Molecular Epidemiology” on Medline2008, more than 2000 on PubMed! 8 国 内 ： 1985年 开 始 , 将 分 子 生 物 学 研 究 中 一 些 技 术 应 用 于 流 行 病 中疾 病 诊 断 以 及 追 踪 传 染 源 的 调 查 研 究 。 1990年 后 在 流 行 病 学 教 材 中 正 式 列 入 分 子 流 行 病 学 一 章 。 从 1992 年 第 4 期 起 , 中 华 流 行 病 学 杂 志 连 续 7 期 发 表 文章 ， 介 绍 分 子 流 行 病 学 的 产 生 、 定 义 、 研 究 内 容 、 研 究 手段 及 其 应 用 。 9 分 子 流 行 病 学 定 义 分 子 流 行 病 学 是 应 用 先 进的 实 验 技 术 测 量 生 物 学 标志 ， 结 合 流 行 病 学 现 场 研究 方 法 ， 从 分 子 水 平 阐 明疾 病 的 病 因 及 其 相 关 的 致病 过 程 ， 并 提 出 与 评 价 相应 防 制 措 施 的 科 学 。 (徐 德 忠 ， 1998年 ) 分 子 流 行 病 学 是 阐 明 疾 病和 健 康 状 态 相 关 生 物 标 志（ 或 分 子 事 件 ） 在 人 群 和生 物 群 体 中 的 分 布 及 其 影响 因 素 ， 并 研 究 防 制 疾 病 、促 进 健 康 的 策 略 与 措 施 的科 学 。 (段 广 才 ， 1999年 ) 10 分 子 流 行 病 学 是 流 行 病 学 的 一 个 分 支 (分 子 生 物 学 ？ 群 体遗 传 学 ？ ) 分 子 流 行 病 学 的 主 要 研 究 内 容 是 各 种 生 物 标 志 物 及 相 关 过程 分 子 流 行 病 学 的 研 究 方 法 是 随 着 分 子 生 物 学 的 进 展 不 断 更新 的几 个 要 点 ： 11 特 点 ： 与 传 统 流 行 病 学 不 同 与 分 子 生 物 学 不 同 与 群 体 遗 传 学 不 同 宏 观 与 微 观 相 结 合 的 人 群 研 究 ！ 12 传 统 流 行 病 学 暴 露 疾 病 ？ 前 瞻 性 研 究回 顾 性 研 究分 子 流 行 病 学 传 统 流 行 病 学 与 分 子 流 行 病 学 的 关 系 （ EDC模 型 ）（ Schulte,1993）暴 露 疾 病 13 研 究 内 容 生 物 标 志 探 讨 暴 露 测 量 (E, ID, BED) 效 应 测 量 (EBE, ASF, CD, PS) 易 感 性 测 量 (DNA, RNA, Protein, Phenotype) 14 生 物 标 志 的 概 念 生 物 标 志 (biological markers , biomarkers) 是 指 能 代 表 生物 结 构 和 功 能 的 可 识 别 物 质 (Phenotype,可 测 量 )。 分 子 生 物 标 志 物 (molecular biomarkers)直 接 反 映 外 来 理化 因 素 与 细 胞 靶 分 子 , 特 别 是 生 物 大 分 子 如 核 酸 和 蛋 白 质的 相 互 作 用 及 其 后 果 , 是 生 物 标 志 的 主 要 部 分 。生 物 标 志 15 生 物 标 志 物 的 种 类 暴 露 标 志 （ exposure marker, ME） 与 疾 病 或 健 康 状 态 有关 的 暴 露 因 素 的 生 物 标 志 ， 称 为 暴 露 标 志 。 外 暴 露 标 志 : 暴 露 因 素 进 入 机 体 之 前 的 标 志 和 剂 量 ， 如病 毒 、 细 菌 、 吸 烟 烟 雾 等 。 内 暴 露 标 志 ： 暴 露 因 素 进 入 机 体 之 后 的 标 志 。 16 1. 体 内 剂 量 标 志 （ ID） ： 外 源 性 物 质 于 暴 露 后 在体 内 可 测 量 到 的 剂 量 标 志 ， 表 示 被 人 体 吸 收 的外 源 性 物 质 （ 性 质 未 改 变 的 或 其 代 谢 产 物 ） 的数 量 。q 吸 烟 - 血 或 尿 中 的 烟 草 代 谢 产 物 可 的 宁 浓 度q 多 环 芳 烃 - 尿 中 的 1- 羟 基 芘 水 平 q 饮 食 暴 露 - 黄 曲 霉 毒 素 B1(AFB1)和 尿 中 N-亚 硝 基 化 合物 的 浓 度q 工 作 暴 露 和 环 境 污 染 - 血 清 或 脂 肪 组 织 中 的 杀 虫 剂DDT、 多 氯 联 苯 PCBs、 二 氧 杂 芑 环 氧 化 物 含 量 17 2. 生 物 有 效 剂 量 标 志 （ BED） ： 表 示 已 与 靶 组 织细 胞 内 DNA或 蛋 白 质 相 互 作 用 的 外 源 性 物 质 或其 反 应 产 物 的 含 量 。 它 是 反 映 靶 细 胞 分 子 内 接 触剂 量 的 生 物 标 志 物 , 主 要 包 括 蛋 白 质 加 合 物 (Protein adduct) 、 DNA 加 合 物 (DNA adduct) 。 18 生 物 有 效 剂 量 标 志DNA加 合 物 苯 并 （ a） 芘 白 细 胞生 物 学 标 志 环 境 暴 露 物 质 生 物 材 料蛋 白 质 加 合 物（ 血 红 蛋 白 ） 环 氧 乙 烯 红 细 胞 19 效 应 标 志 （ effect marker, MEF） 机 体 暴 露 后 产 生 功 能 性 或 结 构 性 的 生物 标 志 ， 称 为 效 应 标 志 。 生 物 学 反 应 标 志 （ BR） : 反 映 了 由 于 结 合 到 靶 细 胞 的 外 源 性 物 质 的 持续 作 用 ， 进 一 步 引 起 细 胞 与 组 织 的 生 物 学 或 生 化 学 的 变 化 。 这 些 变 化主 要 发 生 在 细 胞 特 定 部 位 ， 尤 其 在 基 因 的 某 些 特 定 序 列 ； 这 些 变 化 可引 起 机 体 某 些 不 可 逆 转 的 生 物 学 效 应 。 疾 病 标 志 （ MD） 健 康 状 态 标 志 （ MH） 20 生 物 学 反 应 标 志生 物 学 标 志 环 境 暴 露 物 质 生 物 材 料染 色 体 诱 变 化 学 物畸 变 苯 并 （ a） 芘 白 细 胞姊 妹 染 色 体 单 体 交 换 苯 并 （ a） 芘 白 细 胞微 核 （ micronuci） 苯 并 （ a） 芘 白 细 胞癌 基 因 激 活 苯 并 （ a） 芘 组 织原 嘌 呤 比 例 升 高 铅 红 细 胞 乙 酰 胆 碱 脂 酶 降 低 有 机 磷 杀 虫 剂 血 浆 21 亚 临 床 （ 早 期 ） 疾 病 的 生 物 学 标 志 血 清 甲 胎 蛋 白 肝 癌 、 肠 道 疾 病 、 胎 儿 神 经 管 缺 失癌 胚 抗 原 胃 肠 道 癌 、 其 它 胃 肠 道 疾 病肿 瘤 特 异 性 抗 原 各 种 癌 症生 物 学 标 志 疾 病血 清 谷 草 转 氨 酶 心 肌 梗 塞 22 易 感 性 标 志 （ susceptibility markers, MS） 个 体 对 疾 病 发生 、 发 展 易 感 程 度 的 生 物 标 志 。 易 感 性 主 要 与 宿 主 的 遗 传 特 征 ,以 及 生 长 发 育 、 营 养 、 免疫 、 机 体 活 动 状 态 等 有 关 。 不 同 疾 病 的 不 同 阶 段 ， 都 有可 能 具 有 不 同 的 易 感 性 标 志 。 易 感 性 影 响 着 其 它 生 物 学 标 志 在 机 体 内 的 水 平 ； 不 同个 体 的 易 感 性 不 同 ， 与 之 相 关 的 其 它 生 物 学 标 志 的 水 平也 可 以 不 同 。 23 突 变 剂 敏 感 性 分 析 24 易 感 性 基 因 标 志 物 ：1.人 类 基 因 组 多 态 性 (SNPs, CNVs)2.基 因 组 表 遗 传 修 饰 (甲 基 化 ， 乙 酰 化 ) 25 26 SNP是 指 在 人 群 中 出 现 的 频 率 1%的 先 天 突 变 。 SNP存 在 于 整 个 人类 基 因 组 中 ， 可 能 每 100300bp就 存 在 一 个 SNP， 估 计 总 数 在 数 百 万 个 人 类 基 因 组 计 划 研 究 结 果 表 明 ， 不 同 个 体 的 基 因 99.9%是 一 样 的 ，但 在 序 列 上 有 极 小 (0.1%)的 遗 传 差 异 ， 其 中 主 要 是 SNP。 研 究 表 明 ， 正 是 这 0.1%的 差 异 授 予 你 我 他 特 有 的 表 型 ； 这 个 小 小 的差 异 还 与 个 体 对 疾 病 (包 括 肿 瘤 )的 易 感 性 、 对 药 物 的 反 应 性 差 别 有 密切 关 系 。 单 核 苷 酸 多 态(Single nucleotide polymorphism, SNP) 27 SNP1 (locus 1) SNP2 (locus 2)G AT C 基 因 型 G/T A/C GATC Modified from Yang http:/www.bioinfoamss.org/seminars/ppt/hap-pool.ppt. 28 Haplotype Blocks 单 倍 型 区 段 人 类 基 因 组 是 由 呈 现 高 度连 锁 不 平 衡 (LD)的 快 状 区段 排 列 构 成 的 这 些 区 段 是 由 小 的 低 LD的重 组 热 点 区 域 分 隔 的 一 个 单 倍 型 区 段 可 以 由 一些 常 见 的 单 倍 型 的 组 合 来代 表 ChromosomesSNPS Haplotype BlockPatil, Science, 2001 29 分 子 流 行 病 学 的 应 用1、 疾 病 病 因 的 探 讨 遗 传 因 素 起 重 要 作 用 的 疾 病 往 往 与 基 因 有 关 ， 这 不 言 而 喻 ； 而 很多 与 环 境 因 素 有 关 的 疾 病 ， 也 常 常 需 从 基 因 方 面 去 研 究 ， 因 为 环 境因 素 可 以 通 过 宿 主 的 基 因 突 变 或 异 常 表 达 引 起 疾 病 。 慢 性 非 传 染 性 疾 病 肝 癌 黄 曲 霉 毒 素 （ 体 内 外 检 测 ） 传 染 病 AIDS、 SARS （ 分 子 分 型 ） 30 2、 疾 病 分 布 规 律 以 及 危 险 因 素 致 病 机 理 的 研 究 分 子 流 行 病 学 不 仅 研 究 环 境 与 宿 主 体 内 的 致 病 因 子 ，而 且 着 重 研 究 这 些 致 病 的 危 险 因 素 ， 特 别 是 化 学 物 质 与 生 物活 性 物 质 从 暴 露 开 始 至 疾 病 发 生 全 过 程 的 各 个 环 节 。 慢 性 非 传 染 性 疾 病 鉴 定 各 种 恶 性 肿 瘤 的 危 险 因 素 , 并根 据 个 体 暴 露 与 遗 传 等 易 感 因 素 的 相 互 作 用 , 确 定 危 险 度 , 筛选 对 特 定 致 癌 因 子 敏 感 的 个 体 和 亚 群 。 传 染 病 如 确 定 风 疹 病 毒 （ RV） 和 巨 细 胞 病 毒 （ CMV）等 在 人 群 中 母 婴 传 播 的 危 害 程 度 有 多 大 ， 诱 发 畸 形 或 死 产 、流 产 的 危 险 度 如 何 等 。 31 3 、 疾 病 易 感 性 的 测 定 在 相 同 的 致 病 因 素 作 用 下 ， 只 有 一 部 分 人 发 生 某 种 疾 病 。这 是 因 为 人 群 对 致 病 因 子 的 反 应 存 在 个 体 差 异 ， 只 有 一 部 分 人对 其 易 感 。 慢 性 非 传 染 性 疾 病 肿 瘤 的 遗 传 易 感 性 在 暴 露 到 疾 病 发 生 的每 一 步 都 起 作 用 ， 包 括 人 群 中 较 常 见 、 低 危 险 度 的 遗 传 多 态 性和 高 外 显 率 、 人 群 中 罕 见 的 抑 癌 基 因 突 变 。 传 染 病 测 定 机 体 内 是 否 存 在 某 种 特 异 性 保 护 （ 中 和 ） 抗 体的 方 法 了 解 其 对 某 种 传 染 病 是 否 具 有 易 感 性 或 免 疫 力 。 32 4、 防 治 效 果 评 价传 染 病 预 防 提 出 的 控 制 措 施 更 有 针 对 性 ， 更 有 成 效 基 因 工 程 疫 苗 研 制 非 传 染 病 的 预 防 分 子 机 理 的 探 讨 、 易 感 标 志 物 的 确 定 ， 为 筛 选 和 确 定 高危 险 人 群 提 供 了 科 学 依 据 ， 使 慢 性 病 的 预 防 更 具 有 针 对 性 。 可 以 缩 短 效 果 评 价 周 期 ! 33 研 究 方 法测 量 指 标 的 一 般 原 则 生 物 标 志 应 特 异 、 稳 定 ； 标 本 采 集 、 储 存 方 便 ； 检 测 方 法 比 较 简 单 、 实 用 ， 而 且 操 作 规 范 ， 便 于与 同 类 研 究 结 果 比 较 。 检 测 方 法 灵 敏 度 和 特 异 度 高 。 34 常 用 的 实 验 室 检 测 技 术 核 酸 技 术 （ DNA & RNA）核 酸 体 外 扩 增 （ PCR）核 酸 电 泳 图 谱 核 酸 酶 切 电 泳 图 谱 （ RFLP）核 酸 分 子 杂 交 有 原 位 杂 交 、 斑点 杂 交 、 转 印 杂 交 （ 包 括Southern blot检 测 DNA和Northern blot检 测 RNA） 等 。核 酸 序 列 分 析 蛋 白 质 技 术 蛋 白 质 分 离 鉴 定 技 术 主 要 有 ： 电泳 、 凝 胶 电 泳 、 蛋 白 质 转 印 杂 交 （ Western blot） 、 色 谱 分 析 、 蛋白 质 测 序 等 。 酶 学 技 术 包 括 定 性 和 定 量 检 测 ， 要 求 一 定的 条 件 。多 位 点 酶 电 泳 （ multilocus enzyme electrophoresis, MEE） 法 。 其 它 技 术 免 疫 学 技 术 ： 酶 联 免 疫 吸 附 试 验（ ELISA） 、 荧 光 免 疫 试 验（ FIA） 、 放 射 免 疫 试 验 （ RIA） 、免 疫 细 胞 化 学 检 测 （ ICC） 等 ； 色 谱 技 术 ： 高 效 液 相 色 谱 技 术HPLC） 、 液 相 蛋 白 色 谱 技 术（ FPLC） 等 。 35 Automated Liquid HandlerSpectroPREPTM Nanoliter DispenserSpectroJET TM MALDI-TOF Mass SpectrometerSpectroREADERTM Automated AnalysisSpectroTYPERTMMiniaturized BiochipSpectroCHIPTM 36 Blood Sample Processing and Biomarker Assay Flow Chart 37 实 验 室 中 的 质 量 控 制1 一 般 实 验 质 量 控 制 (1)标 本 采 集 和 储 存 (2)试 剂 和 材 料 (3)仪 器 (4)实 验 方 法 (5)操 作 规 范2 设 立 多 重 对 照 为 保 证 检 测 质 量 ， 可 以 设 立 多 种 对 照 ， 而 且 可 以 采取 “ 盲 法 ” 。 (1)标 准 对 照 (2)空 白 对 照 (3)重 复 对 照3 重 复 试 验 (1)实 验 室 内 重 复 试 验 (2)实 验 室 间 重 复 试 验 38 研 究 实 例 39 年 龄 调 整肺 癌 发 病 率 2002 (10万 -1)Parkin et al. CA Cancer J Clin. 2005 40 中 国 烟 草 生 产 及 销 售 情 况 资 料 来 源 :中 国 烟 草 发 展 报 告 41 Yang et al. JAMA 1999 中 国 人 群 年 龄 和 性 别 特 异 的 吸 烟 率 6.9 %60.2 %2001 35-74Gu et al. Am J Public Health 200410.6 % 42 性 别 特 异 的 非 吸 烟 者“ 二 手 烟 ” 暴 露 情 况2000-2001Gu et al. Am J Public Health. 2004男 性女 性 43 肺 癌暴 露 非 肺 癌遗 传 易 感 性 ? 44 Genetic Susceptibility 45 “Genetics loads gun, but Environments trigger.” 46 Category of SNPsu Coding SNPs (cSNPs): non-synonymous SNPs (nsSNPs) synonymous SNPs (sSNPs)u Non-coding SNPs (ncSNPs): regulatory SNPs (rSNPs) Other intronic SNPs (iSNPs) rSNPs: located at 3UTR/5UTR, promoter region or exon-intron boundaryThe large number of other intronic SNPs! Only genetic marker? 47 Common genetic variants in miRNAs and flaking regions Hu Z, Chen J, Tian T, et al. JCI 2008PNAS 104(9):3300-3305,2007 48 Hu Z, Chen J, Tian T, et al. JCI 2008 Common Pre-miRNA SNPs and miRNA secondary structure prediction using Mfold 3.2 49 Genotype-phenotype correlation Hu Z, Chen J, Tian T, et al. JCI 200850 Predicted targets of mir-196a2 3p and Report gene assaysMiRNAs Genes Full name or Alternative titles P value3p LSP Lymphocyte-specific protein 1 2.73E-03KIF Kinesin-like protein KIF 2.89E-03PSMD10 26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 10 2.92E-03BAG3 BAG family molecular chaperone regulator 3 3.14E-03ALOX15 Arachidonate 15-lipoxygenase 3.25E-03 Hu Z, Chen J, Tian T, et al. JCI 200851 Pre-miRNAs SNPs and NSCLC patients survivalGenotype Test Set, TS Validation Set, VS Log-rank P TS/VS/Merged A Adjusted HR B (95% CI) CPatients Deaths Patients Deaths (n = 556) (n=223) (n = 107) (n=45)miR-146a rs2910164CC 98 34 24 13 1.00 CG 272 102 52 23 1.05(0.75-1.47)GG 186 87 31 9 0.229/0.377/0.506 1.28(0.89-1.82)miR-149 rs2292832GG 66 26 10 5 1.00 GT 247 95 53 17 1.03(0.69-1.54)TT 243 102 44 23 0.306/0.106/0.060 1.32(0.89-1.97) GG/GT 313 121 63 22 1.00 TT 243 102 44 23 0.129/0.055/0.023 1.29(1.01-1.65)miR-196a2 rs11614913TT 152 61 32 11 1.00 CT 264 99 52 20 1.09(0.81-1.46)CC 140 63 23 14 0.095/0.081/0.016 1.86(1.32-2.62)TT/CT 416 160 84 31 1.00 CC 140 63 23 14 0.032/0.033/0.004 1.76(1.34-2.33)miR-499 rs3746444AA 411 162 80 31 1.00 AG 131 55 27 14 1.11(0.84-1.46)GG 14 6 0 0 0.958/0.454/0.859 1.24(0.55-2.83)Hu Z, Chen J, Tian T, et al. JCI 2008 52 分 子 流 行 病 学 目 前 面 临 的 问 题 和 展 望1、 干 扰 或 混 杂 因 素 的 影 响2、 生 物 标 志 物 的 应 用 局 限 性3、 疾 病 位 点 的 低 外 显 率 问 题 和 高 阶 交 互 作 用4、 Epistatic 疾 病 位 点5、 生 物 统 计 学 方 面 的 制 肘 6、 多 中 心 合 作 和 行 业 规 范 53 Traditional EpidemiologyOne tree at a time 54 “-Omic” EpidemiologyForests & Mountains 55 56