肿瘤的基因诊断

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,肿瘤的分子诊断,Moleculardiagnosis of tumors,多基因疾病,是指疾病的发生涉及,两个以上基因,的结构或表达调控的改变。分子诊断是指利用分子生物学和分子遗传学的方法，通过检测,基因的存在、结构变异和表达的异常,，对人类状态和疾病做出诊断的方法。,肿瘤的分子诊断,是指用分子生物学手段，通过,检测肿瘤相关基因的存在，分析肿瘤相关基因的缺陷、表达及其功能,，以达到肿瘤诊断的目的。,概 念,一、肿瘤发生发展的分子机制,肿瘤自身原因,外因,内因,无限增殖,转移,空间,资源,免疫监控,攘外,安内,同流和污,视而不见,肿瘤免疫监控失活,功能丧失,一、肿瘤发生发展的分子机制,1、肿瘤自身,一、肿瘤发生发展的分子机制,1、肿瘤自身,Limitless replicative,potential,Tissue invasion,&metastasis,Sustained,angiogenesis,Insensitivity to,anti-growth signals,Self-sufficiency in,growth signals,Evading,apoptosis,一、肿瘤发生发展的分子机制,1、肿瘤自身,Self-sufficiency in growth signals,Autocrine loops,Over-expression of receptor,Receptor is always on,Downstream signals,一、肿瘤发生发展的分子机制,1、肿瘤自身,External triggers,Intracellular triggers,Death receptors,Caspases,Sensors(8,9),Executioners(3),Evading apoptosis,一、肿瘤发生发展的分子机制,1、肿瘤自身,Insensitivity to antigrowth signals,一、肿瘤发生发展的分子机制,1、肿瘤自身,Sustained angiogenesis,VEGF(血管内皮生长因子),FGF1/2（成纤维细胞生长因子）,Thrombospondin,Thalidomide,Avastin,一、肿瘤发生发展的分子机制,1、肿瘤自身,Tissue invasion and metastases,一、肿瘤发生发展的分子机制,1、肿瘤自身,Limitless reproductive potential,Hayflick hypothesis,Limited number of doublings,Telomere maintenance,Telomerase,Not all tumor cells have this potential,Tumor stem cells,(1)免疫监视系统,要素,识别力,攻击力,组成,分工,快速反应,特异反应,信息传递,一、肿瘤发生发展的分子机制,2、免疫监控失调,（1）、免疫监视系统,识别,特异反应,抗原递呈细胞,一、肿瘤发生发展的分子机制,2、免疫监控失调,（1）、免疫监视系统,攻击,效应细胞,一、肿瘤发生发展的分子机制,2、免疫监控失调,（2）、免疫监视系统与肿瘤发生,证据,体内细胞突变随时在发生，但肿瘤不是随时发生。,免疫缺陷与肿瘤发生,免疫功能与肿瘤发展,一、肿瘤发生发展的分子机制,2、免疫监控失调,（2）、免疫监视系统与肿瘤发生,肿瘤监控失常原因,识别问题,肿瘤自身,免疫细胞,隐蔽抗原,来源与正常细胞相同,抗原递呈功能缺失,无视,一、肿瘤发生发展的分子机制,2、免疫监控失调,（2）、免疫监视系统与肿瘤发生,肿瘤监控失常原因,杀伤问题,肿瘤自身,免疫细胞,杀伤免疫细胞,抑制因子,功能异常,抑制性免疫细胞,一、肿瘤发生发展的分子机制,2、免疫监控失调,二、肿瘤的分子诊断内容,肿瘤标志物的检测,1978年Herberman在美国国立癌症研究所召开的人类肿瘤免疫诊断会上提出的。由肿瘤组织和细胞产生的与肿瘤的形成、发生相关的物质,这些物质存在于肿瘤细胞的胞核、胞质、胞膜上或体液中；不存在于正常成人组织而见于胚胎组织,或在肿瘤组织中含量超过正常含量。存在于肿瘤患者的组织、体液和排泄物中，能够用免疫学、生物学及化学的方法检测。,原癌基因,癌基因,病毒癌基因,肿瘤抑制基因,肿瘤转移相关基因,肿瘤耐药基因等,肿瘤相关基因,细胞基因组中调控细胞增殖和分化且具有能够使正常细胞发生恶性转化的基因，包括病毒癌基因和细胞癌基因；,癌基因在正常细胞的基因组中,存在,不表达状态,表达水平不足以引起细胞的恶性转化,癌基因：,定位,功能,癌基因，产物,分泌蛋白,生长因子,sis PDGF链,跨膜蛋白,受体型酪氨酸激酶,erb B2,EGF样受体,erb B,EGF受体,fms,CSF-1受体,膜结合蛋白,G-蛋白,非受体型酪氨酸激酶,ras p21ras,src pp60src,胞浆可溶性蛋白,非受体型酪氨酸激酶,丝氨酸/苏氨酸激酶,信号转导连接蛋白,Raf，ab1,crk,SH2/SH3调节蛋白,vav,SH2调节蛋白,胞核蛋白,转录因子,Myb，myc,fos,jun,erb A,T3受体,表1细胞癌基因按其产物定位和功能分类,能够抑制细胞恶性转化或抑制细胞异常,增殖的基因,目前研究较多的有p53基因、pRB基因、p16蛋白、p15蛋白、p21等。,抑癌基因,基因,染色体定位,相关肿瘤,基因产物及功能,RB,13q14,RB、成骨肉瘤、胃癌、SCLC、乳癌、结肠癌,p105，控制生长,WT,11p13,WT、横纹肌肉瘤、肺癌、膀胱癌、乳癌、肝母细胞瘤,WT-ZFP，负调控转录因子,NF-1,17p12,神经纤维瘤、嗜铬细胞瘤、雪旺氏细胞瘤、神经纤维肉瘤,GAP，拮抗p21rasB,DCC,18q21.3,结肠瘤,P192,细胞粘附分子,p53,17p13,星状细胞瘤、胶质母细胞瘤、结肠癌、乳癌、成骨肉瘤、SCLC、胃癌、磷状细胞肺癌,P53 控制肿瘤生长,erb A,17q21,ANLL,T3受体，含锌指结构的转录因,表2 已确定的几种抑癌基因,野生型P53生物学活性,当DNA损伤的时候,P53基因就明显表达使细胞在G1期生长阻滞，促使细胞凋亡。,抑制肿瘤细胞生长,保持DNA完整性,包括肿瘤转移促进基因或肿瘤转移抑制,基因,。,肿瘤转移相关基因,肿瘤耐药基因,其表达使肿瘤细胞对药物产生耐药的基因。,血小板衍生生长因子（PDGF）,表皮生长因子（EGF）,VGF基因等,肿瘤生长因子,肿瘤的基因诊断,肿瘤的基因诊断目前主要集中在以下几个方面：,肿瘤转移标志物,肿瘤抗药基因,突变的癌基因,肿瘤相关的病毒基因,标志分类,机制,分子标志,应用于癌症诊断,分子遗传性,染色体易位,t(9；22)，t（14；18），t(11；12)等,白血病、淋巴瘤等,点突变,p53,ER ras等,胃癌、膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、胰腺癌、肺癌等,缺失,BRCA1，BRCA2，DCC等,乳腺癌、结肠癌,改变拼接,CD44，muc-1,VLA-4等,结肠癌、肾癌、乳腺癌、脑瘤等,扩增,erb-B2,EGFR,N-myc,ras,乳腺癌、脑瘤、神经母细胞瘤,比例改变,明胶酶A/TIMP2,乳腺癌转移等,病毒性,病毒转化,HPV,HCV,HBV，EBV,宫颈癌、肝癌、鼻咽癌等,组织性,组织分化,PSA,PSMA,前列腺癌,muc-18,酪氨酸酸酶，Mage-3,黑素瘤,AFP,白蛋白,肝癌,甲状腺球蛋白,甲状腺癌,NPGP9.5，酪氨酸羟化酶表面活性物质等,神经母细胞瘤,肿瘤性,肿瘤细胞特征,CEA,肺癌、,结肠癌、胃癌、乳腺癌,-HCG,黑素瘤等,CK-19,肺鳞癌,端粒酶,结肠癌、乳腺癌、头颈部癌等,微卫星体等,结肠癌、乳腺癌、头颈部癌等,表3,肿瘤基因诊断的分子标志及其应用,可分为四大类,组织特异性基因标志,肿瘤特异性基因标志,血管生成因子,其它与肿瘤转移相关的分子及基质蛋白酶及其抑制剂,肿瘤转移基因标志物,组织特异性基因标志物,指肿瘤组织和/或起源正常组织所特有，在淋巴组织和血细胞中不存在的。如角质蛋白家族（CK）mRNA、粘蛋白基因、表皮生长因子受体（EGFR）mRNA等。,存在于肿瘤及其起源的正常细胞中，不存在于其他细胞。,如CEA mRNA、AFP mRNA、PSA mRNA等,血管生成因子,如血管内皮细胞生长因子（VEGF）等。,突变的癌基因,癌基因的突变是癌基因激活的重要方式和途径。除了见到较大范围片段的缺失或插人以及染色体转位之外，大多数情况下，都是少数核苷酸或单个碱基的突变。.,癌基因点突变的检测,单链构象多态性（SSCP）检测技术等,.,肿瘤相关的病毒基因,EB病毒（EBV）,人乳头瘤病毒（HPV）,乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）感染,对于这些肿瘤组织细胞中相关病毒基因及其编 码产物的检测，可以作为这些类型的肿瘤诊断的标志。,致瘤病毒引起的恶性转化作用引起了人们极大的关注,肿瘤基因诊断的常用方法,PCR、RT-PCR,Southern blot杂交技术、Northern blot杂交技术,基因芯片,基因测序。,肿瘤基因的分子诊断意义,1.肿瘤的早期诊断和筛选,2.肿瘤疗效监测,3.肿瘤的预后判断,4.肿瘤微转移检测,肿瘤基因检测在肿瘤微转移检测中应用举例,前列腺癌特异性基因DD3,PCA3,DD3,PCA3,是一种非编码RNA的基因，定位于9q2122染色体。它为前列腺癌特异性基因之一，DD3,PCA3,mRNA仅在前列腺癌细胞中表达，而在其它正常组织和癌组织以及细胞系中均不表达。,DD3 mRNA 14外显子扩增结果,M：50bp DNA Ladder；1：LNCaP阳性对照；2 3：PCa；4：PIN(前列腺上皮内瘤变,)；5 6：BPH(前列腺增生)；7：直肠癌；8：直肠癌癌旁；9：结肠癌；10：结肠癌癌旁；11：乳腺癌；12：甲状腺癌；13：胃癌；14：胃癌癌旁；15：膀胱癌；16：软组织纤维肉瘤；17：转移性腺癌；18：淋巴结转移性黑色素瘤；19：卵巢成熟性畸胎瘤；20：正常肝脏；21：胆囊；22：胎盘；23：试剂空白。,DD3 mRNA 13外显子扩增结果,M：50bp DNA Ladder；1：LNCaP阳性对照；2 3：PCa；4：PIN；5 6：BPH；7：直肠癌；8：直肠癌癌旁；9：结肠癌；10：结肠癌癌旁；11：乳腺癌；12：甲状腺癌；13：胃癌；14：胃癌癌旁；15：膀胱癌；16：软组织纤维肉瘤；17：转移性腺癌；18：淋巴结转移性黑色素瘤；19：卵巢成熟性畸胎瘤；20：正常肝脏；21：胆囊；22：胎盘；23：试剂空白。,DD3 mRNA 34外显子扩增结果,M：50bp DNA Ladder；1：LNCaP阳性对照；2 3：PCa；4：PIN；5 6：BPH；7：直肠癌；8：直肠癌癌旁；9：结肠癌；10：结肠癌癌旁；11：乳腺癌；12：甲状腺癌；13：胃癌；14：胃癌癌旁；15：膀胱癌；16：软组织纤维肉瘤；17：转移性腺癌；18：淋巴结转移性黑色素瘤；19：卵巢成熟性畸胎瘤；20：正常肝脏；21：胆囊；22：胎盘；23：试剂空白。,前列腺组织和其他肿瘤组织及癌旁组织DD3 mRNA检测结果,M：50bp DNA标准；1：LNCaP阳性对照；2：BPH；3：健康男性志愿者；410为PCa；11为试剂空白。,外周血DD3 mRNA的RT-PCR扩增电泳图,RT-PCR检测结果,44例PCa组中13例可见DD3 mRNA阳性结果(其中B期、C期及D期分别有为0例、2例，11例)。,30例BPH患者和18名健康男性志愿者标本中均未检出DD3 mRNA。,外周血DD3 mRNA的巢式RT-PCR扩增电泳图,M：50bp DNA分子量标准；1：LNCaP阳性对照；2：阴性对照(女性)；3：BPH患者；,4：健康男性志愿者；58：