PCR技术上岗培训课件

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,PCR技术上岗培训,疾病的诊断,分子诊断,影象学,诊断,细胞,/,组,织诊断,临,床,诊,断,免疫诊断,2,几乎所有的疾病都是基因病,科学研究已证明，基因可以揭示疾病的本质，人类几乎所有疾病都直接或间接与基因有关，在某种意义上都是基因病，,3,4,5,6,PCR,技术,1985,年美国人莫里斯（,Kary Mullis,）发明了一种模拟,DNA,体内复制过程，在体外复制特定,DNA,片段的方法，并将其命名为聚合酶链式反应（,PolymeraseChain Reaction,，,PCR,）。,PCR,可以在短时间内倍增极微量,DNA,（理论上说,仅有一个足够了）至百万或十亿倍，通过,PCR,可以简便、快速地从微量生物材料中获得大量特定的核酸，并具有很高的灵敏度和特异性，可用于微量核酸样品的检测。,7,PCR,技术,PCR,技术被科学界誉为生物技术领域最伟大的发明之一，美国人莫里斯在发明该技术不久就因此于,1993,年获得诺贝尔化学奖。,PCR,及其相关技术于,80,年代末在国外开始应用：欧共体（现欧盟）、日本、美国相继把,PCR,这一基因诊断核心技术列入献血员筛查，美国食物与药品管理局已批准了,60,多种基因诊断试剂用于临床，美国国家疾病控制中心已把,PCR,技术列入疾病诊断的常规技术。,8,大家有疑问的，可以询问和交流,可以互相讨论下，但要小声点,9,10,1.DNA,变性（,90-96,）：双链,DNA,模板在热作用下，氢键断裂，形成单链,DNA2.,退火（,25-65,）：系统温度降低，引物与,DNA,模板结合，形成局部双链。,3.,延伸（,70-75,）：在,Taq,酶（在,72,左右最佳的活性）的作用下，以,dNTP,为原料，从引物的,5,端,3,端延伸，合成与模板互补的,DNA,链。每一循环经过变性、退火和延伸，,DNA,含量既增加一倍。,标准的,PCR,过程分为三步,11,荧光,PCR,检测技术是在传统,PCR,技术基础上，加入荧光标记的基因探针，通过探针与扩增产物的结合释放出荧光信号，再通过专门的仪器（荧光,PCR,仪）对荧光信号的实时检测，经过电脑分析以后，可以准确计算出目的基因的初始数量，实现定量检测。与传统,PCR,检测相比，荧光,PCR,检测技术不仅实现了,PCR,检测从定性到定量的飞跃，而且它具有特异性更强、有效解决,PCR,污染问题、自动化程度高等特点。因此，荧光,PCR,检测技术自二十世纪九十年代中期出现以来，已成为最具代表性的,PCR,检测技术，为,PCR,检测技术临床应用打开了方便之门，现已得到广泛应用。,荧光,PCR,检测技术简介,12,短柄圆环探针荧光,PCR,原理,分子信标是一种荧光标记的寡核苷酸链，一般含有,25,35,个核苷酸。在结构上，分子信标大体上可以分为三部分：（,1,）、环状区：一般由,15,30,个核苷酸组成，可以与靶分子特异结合；（,2,）、茎干区：一般由,5,8,个碱基对组成，在分子信标与靶分子结合过程中可发生可逆性解离。（,3,）、荧光基团和淬灭基团：荧光基团一般连接在,5,端；淬灭基团一般连接在,3,端，常用,4-,（,4-,二甲基氨基偶氮苯基）苯甲酸（,DABCYL,）作为淬灭基团。根据,Foerster,理论，中心荧光能量转移效率与两者距离的,6,次方成反比。所以只有荧光基团与淬灭基团之间达到一定的距离时才会产生荧光。,13,荧光标记,荧光发光是通过激发光激发荧光基团到达高能量状态,而后产生发射光。常用的有绿色荧光蛋白,(GFP),、红色荧光蛋白,DsRed,、,CY3,、,CY5,、,FAM,及其它荧光报告基团,14,探针荧光标记及,荧光基团：如红色荧光,Cy3,和绿色荧光,Cy5,标记探针,淬灭基团常：用,4-,（,4-,二甲基氨基偶氮苯基）苯甲酸（,DABCYL,）,15,影响分子信标的主要因素,分子信标中，荧光基团和淬灭基团之间的距离是影响分子信标的最主要因素。根据,Foerster,理论，荧光基团与淬灭基团之间的距离直接影响荧光的强度。,另外，温度也是影响分子信标的一个重要因素。在较低温度下，分子信标才可以保持发卡结构。在较高温度下，分子信标将无法保持其发卡结构，甚至使其伸展为随机线状，造成荧光基团和淬灭基团分离，从而发出荧光，出现假阳性结果。有文献表明，其熔链温度取决于茎干区的长度、,G-C,含量和缓冲液的离子强度,16,PCR,反应特点,特异性强,灵敏度高,PCR,产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克,(pg=10-12),量级的起始待测模板扩增到微克,(ug=-6),水平。能从,100,万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，,PCR,的灵敏度可达,3,个,RFU(,空斑形成单位,),；在细菌学中最小检出率为,3,个细菌。,简便、快速,PCR,反应用耐高温的,Taq DNA,聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在,DNA,扩增液和水浴锅上进行变性,-,退火,-,延伸反应，一般在,2,4,小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。,对标本的纯度要求低,不需要分离病毒或细菌及培养细胞，,DNA,粗制品及,RNA,均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等,DNA,扩增检测。,17,实时荧光,PCR,结果判读,18,荧光,PCR,试剂盒检测结果,19,20,21,荧光域值（,threshold,）的设定,PCR,反应管的前,15,个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是,PCR3-15,个循环荧光信号标准差的,10,倍，即：,threshold=10sd cycle6-15.,荧光域值设定在,PCR,扩增的指数期。,22,Ct,值,在荧光定量,PCR,技术中，有一个很重要的概念,Ct,值。,C,代表,cycle,，,t,代表,threshold,，,Ct,值的含义为每个反应管内荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。个模板的,Ct,值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，,Ct,值越小，起始拷贝数越多，反之亦然。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表,Ct,值。因此，只要获得未知样品的,Ct,值，就可从标准曲线上算出该样品的起始拷贝数。,23,PCR,诊断试剂生产管理要点,1,、应具有阳性血清（或阳性质粒）处理、分装的隔离实验室,2,、,PCR,试剂的生产区与检定区应严格分开,3,、专用原材料,PCR,引物的设计要合理、合适，引物的合成要有固定的地方和设备，纯度能到达一定标准,24,荧光定量,PCR,试剂的质量检查操作程序,每次买来一批新试剂时，先观察外包装有无破损及有效期等，试剂运输过程中有无冷冻保存，如有异常，及时与厂家联系。,内包装：试剂是否漏液，真空包装是否破损，试剂是否齐全以及是否有使用说明书等。,试剂的灵敏度：取卫生部临检中心购买的已知拷贝数的血清,1,份，并稀释至,10,拷贝数，用新试剂检测，计算出灵敏度。,试剂的重复性：取从卫生部临床检验中心购买的已知拷贝数的血清,1,份，用新试剂稀释平行检测,10,次，计算出,SD,，,CV%,。,CV%,应在,30%,。,试剂的特异性：取临床标本,10,份（包括：低拷贝、高拷贝、阴性、高黄疸的标本各,2,份），用新试剂检测，用于考察试剂的特异性。,25,荧光定量,PCR,室内质控程序,每天门诊抽取病人血标本时，须先仔细认真核对化验单和病人姓名是否符合。,编完化验单号后，在对血标本进行编号时要仔细核对化验单的病人姓名与标本管上的姓名，不得有误。,每次试验中，须同时测定,1,份阴性对照与一份质控品。,首次制作质控图时（新批号开始时），采用,“,即刻法,”,质控方法，具体步骤如下：,将连续的质控测定值从小到大排列，即,X1,，,X2,，,XN,计算均值,(X),和标准差,(S),按下述公式计算,SI,上限和,SI,下限,SI,上限,=(X,最大值,-X,均值,)/2,SI,下限,=(X,均值,-X,最小值,)/2,26,PCR,定量为何要设内参照？,影响,PCR,定量的主要原因有,1,、反应效率的差异：可能为反应体系和,PCR,扩增仪的工作状态所致。由于,PCR,产物增加按指数方式进行，所以扩增效率即使相差极小，也会极大改变产物的浓度。解决办法就是设内对照，使参照基因在同一反应管内进行,PCR,扩增，起到校正作用，这样，任何影响扩增效率的因素同样会影响两种模板。,2,、终产物浓度的影响：终产物浓度达到一定水平后，不会再保持指数式增长，而是进入平台期。解决办法：系列稀释待测模板，或在一定,PCR,反应周期后间隔测定,PCR,终产物的浓度。,27,PCR,诊断试剂质量控制要点,1,、酶活性测定,2,、引物序列的确定,3,、,PCR,加样区、扩增区、检测区应严格分开,4,、选择特异、敏感及简单快速的,PCR,产物检测方法,28,5,、,DNA,聚合酶的活性及稳定性能达到一定的要求，并有固定的来源,6,、,PCR,产物检测方法要尽可能的可靠、快速方便,7,、,PCR,试剂盒的检定人员应进行专门的培训,29,