Western-blot-技术-详细版课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,Western blot,实验技术,定义：,印迹法（,blotting,）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。,1975,年，,Southern,建立了将,DNA,转移到硝酸纤维素膜（,NC,膜）上，并利用,DNA,RNA,杂交检测特定的,DNA,片段的方法，称为,Southern,印迹法。,而后人们用类似的方法，对,RNA,和蛋白质进行印迹分析，对,RNA,的印迹分析称为,Northern,印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为,Western,印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为,Eastern,印迹法,Western Blot,基本原理,在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。,快速、特异，信号弱、昂贵,信号强、二抗选择多，非特异性结合,Western Blot,一般流程,SDS,聚丙烯酰胺,凝胶电泳,转膜,封闭,一抗杂交,二抗杂交,底物显色,蛋白样品的制备,蛋白样品的制备,裂解液,只能识别非变性的抗原表位的抗体，不能选择,SDS,及强去污剂的裂解液,研究蛋白之间相互作用，应选择温和非变性裂解液,对于难溶解蛋白，应选用裂解强度更高的裂解液（如,RIPA,SDS),SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳,原理,：,SDS,是一种离子性的界面活性剂,它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水,性的长碳链,.,当,SDS,与蛋白质混合时,它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺,基酸结合将蛋白质包起来,而以硫酸根离子外露与水分子作用,.,大多数蛋,白质和,SDS,的平均结合量是,1:1.4(,以重量为单位,),而蛋白质结合固定,比例之,SDS,後,由於,SDS,带强负价,使蛋白质原先的带电价微不足道,且,每单位重量之蛋白质带电价一致,(charge density),所以决定不同蛋白的泳动速率就只剩下分子大小一项因素,丙烯酰胺和,N,N-,亚甲双丙烯酰胺,SDS,配胶的,Tris,缓冲液,TEMED,过硫酸铵,(,时间,),Tris-,甘氨酸电泳缓冲液,凝胶成份,凝胶浓度与蛋白分离范围,安装玻璃板,对齐、加紧,配胶,混匀、不要过度，防止氧化,转膜,NC,膜,PVDF,膜,结合能力,80-110 ug/cm,2,125-200 ug/cm,2,材料质地,脆,韧性好,溶剂耐受性,无,有,操作程序,缓冲液润湿,100%,甲醇润湿,价格,便宜,较贵,大于,20KD0.45 um,小于,20KD0.2 um,小于,7KD0.1 um,转膜,半干法,将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液湿,润滤纸之间。（小分子量蛋白）,湿法,将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装,置的缓冲液中。（大分子量蛋白）,不能有气泡,不要污染膜的表面,注意正负极,冰浴冷却,湿转,半干转,不能有气泡,滤纸、胶、膜大小要一致，否则容易短路，产热,封闭,脱脂奶粉（,5,）,BSA,Western Blot,膜封闭液（生物试剂公司提供）,一抗、二抗孵育,把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据滤膜面积以,0.1ml/cm2,的量加入加入一抗溶液与滤膜温育。,37,一小时，,4,过夜。,倒掉一抗溶液，用,TBST,漂洗液滤膜,3,次，每次,10min,。,加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，,37,一小时，,4,过夜。,倒掉二抗溶液，用,TBST,漂洗液滤膜,3,次，每次,10min,。,二抗与底物反应显色,辣根过氧化物酶法（,HRP,）,碱性磷酸酶法（,AP,）,化学发光显色法,(,HRP,),DAB,显色法：方便、经济，反应慢、不易保存、不能重新剥离检测,ECL,发光法：灵敏、快速、反应快、能重新剥离检测,Western Blot,常见问题分析,SDS-PAGE,电泳,胶不平？,凝胶漏液？,胶板洗刷干净,加入,APS,和,TEMED,的量要合适,加入试剂后摇匀，使其充分混合，防止部分胶块聚合不均匀,温度合适，受热不均匀导致胶聚合不均匀,两块玻璃板底部要对齐,条带比正常的窄？,“,微笑,”,或,“,倒微笑,”,条带？,凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓,拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，以免把上样带扭曲,样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度,胶板底部有气泡会影响电泳效果，应赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否合适,转膜及抗体检测,凝胶肿胀或卷曲？,条带歪斜或漂移？,单个或多个白点？,转膜缓冲液过热,？,可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡,5-10min,电转仪长期使用导致海绵变薄，,“,三明治,”,结构不紧凑导致。可在两块海绵之间垫上少许普通的滤纸,确保膜和胶块之间没有气泡,缓冲液中离子浓度太低，电流或电压太高。转膜过程注意降温,背景太高,膜没有均匀浸湿,膜或者缓冲液污染,封闭不充分,抗体与封闭剂出现交叉反应,抗体浓度过高,原因,对,策,转膜前用,100%,甲醇将膜完全浸湿,拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转膜缓冲液,检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应,杂交前检测一抗、二抗的工作浓度,没有阳性条带或比较弱,抗体染色不充分,靶蛋白含量太低,HRP,抑制剂,转膜时间不够,曝光时间过短,原因,对,策,增加抗体滴度，延长孵育时间,增加样本上样量,所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠,大分量蛋白相应增加转膜时间及曝光时间,