微生物细胞计数及染色操作

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,微生物细胞计数及染色操作,河南师范大学,环境科学与工程实验教学中心,一、目的要求,学会血球计数板的使用方法,了解革兰氏染色的原理,学习并掌握革兰氏染色的方法,二 酵母细胞计数原理,微生物常用的计数方法有两种，即直接计数法和间接计数法。前者利用血球计数板在显微镜下直接计数，能立即得到数值，但死活细胞都计数在内。后者是在乎板上长成菌落后再计数，反应较真实，但费时太长。本实验是利用血球计数板进行直接计数。计数前需对样品做适当稀释，按照规定方法及计算公式运算后，即可得出实际数值。,细菌染色基本原理,革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。,它是1884年由丹麦医师Gram创立的。,革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。,细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。,肽聚糖(peptidoglycan),革兰阳性菌肽聚糖聚糖骨架、四肽侧链、五肽交联桥,青霉素作用点,溶菌酶作用点,N-乙酰葡糖胺,N-乙酰胞壁酸,革兰阴性菌肽聚糖聚糖骨架、四肽侧链,肽聚糖(peptidoglycan),革兰阳性菌细胞壁特殊组分,壁磷壁酸,膜磷壁酸,革兰阴性菌细胞壁特殊组分,革兰阳性菌与阴性菌细胞壁结构比较,细胞壁,革兰阳性菌,革兰阴性菌,强度,较坚韧,较疏松,厚度,20-80nm,10-15nm,肽聚糖层数,可多达50层,1-2层,肽聚糖含量,占细胞壁干重50%-80%,占细胞壁干重5%-20%,磷壁酸,+,外膜,+,脂蛋白,+,脂多糖,+,革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料（basic dye）初染液；媒染剂（mordant）；脱色剂（decolorising agent）和复染液（counterstain）。,碱性染料初染液结晶紫（crystal violet）,媒染剂碘（iodine）,脱色剂95的酒精（ethanol）,复染液番红,三、实验器材,大肠杆菌，枯草芽孢杆菌、未知菌；,草酸铵结晶紫，番水水溶液，碘液，95%乙醇，载玻片，显微镜等。,显微镜、物镜测微尺、目镜测微尺、血球计数 板、载玻片等。,麦芽汁培养基、酵母菌。,吸管、吸水纸等。,四、实验步骤,1涂片：将培养24小时的大肠杆菌和未知菌，培养12-18小时的枯草芽孢杆球菌、分别作涂片（注意涂片切不可过于浓厚），干燥、固定。固定时通过火焰12次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。,（一）染色实验,2染色,（1）初染：加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗。,（2）媒染：滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗。,（3）脱色：将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约2030秒钟，立即用水冲净酒精。,（4）复染：用番红液染12分钟，水洗。,（5）干燥和镜检：干燥后，置油镜观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。,（6）同法在一载玻片上以大肠杆菌与枯草芽孢杆菌混合制片，作革兰氏染色对比。,革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。,大肠杆菌革兰氏染色,炭疽芽胞杆菌,(二)酵母细胞数的测定操作方法,1.,血球计数板的构造,血球计数板是由一块比普通载玻片厚的特制玻片制成的。玻片中有四条下凹的槽，构成三个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽隔为两半，每半边上面个刻有一个方格网。方格网上刻有,9,个大方格，其中只有中间的一个大方格为计数室，供微生物计数用。这一大方格的长和宽各为,1m,，深度为，其体积为,0.1mm,3,。,计数室通常有两种规格。一种是大方格内分为16中格，每一中格又分为25小格；另一种是大方格内分为25中格，每一中格又分为16小格。但是不管计数室是哪一种构造；它们都有一个共同的特点，即每一大方格都是由16,25=25,16=400个小方格组成，见图。,2.血球计数板的使用,(1)用血球计数板计数酵母菌悬液的酵母菌个数。,(2),样品稀释的目的是便于酵母菌悬液的计数，以每小方格内含有,4-5,个酵母细胞为宜，一般稀释,10,倍即可。,(3)将血球计数板用擦镜纸擦净，在中央的计数室上加盖专用的厚玻片。,(4)将稀释后的酵母菌悬液，用吸管吸取一滴置于盖玻片的边缘，使菌液缓缓渗入，多余的菌液用吸水纸吸取，捎待片刻，使酵母菌全部沉降到血球计数室内。,(5),计数时，如果使用,16,格,25,格规格的计数室，要按对角线位，取左上、右上、左下、右下,4,个中格（即,100,个小格）的酵母菌数。如果,规格为,25,格,16,格的计数板,，除了取其,4,个对角方位外，还需,再数中央的一个中格,(,即,80,个小方格,),的酵母菌数,。,4.血球计数板的清洁,血球汁数板使用后，用自来水冲洗，切勿用硬物洗刷，洗后自行晾干或用吹风机吹干，或用,95,的乙醇、无水乙醇、丙酮等有机溶剂脱水使其干燥。通过镜检观察每小格内是否残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复清洗直到干净为止。,1结果,列表比较大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和未知菌的染色反应，并判断它们分别是G,-,或G,+,.,2思考题,（1）作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？其染色成败的关键一步是什么？,（2）当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样能确证你的染色技术操作正确，结果可靠？,五、实验报告,谢谢观看,/,欢迎下载,BY FAITH I MEAN A VISION OF GOOD ONE CHERISHES AND THE ENTHUSIASM THAT PUSHES ONE TO SEEK ITS FULFILLMENT REGARDLESS OF OBSTACLES.BY FAITH I BY FAITH,内容总结,微生物细胞计数及染色操作。后者是在乎板上长成菌落后再计数，反应较真实，但费时太长。计数前需对样品做适当稀释，按照规定方法及计算公式运算后，即可得出实际数值。革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰阳性菌肽聚糖聚糖骨架、四肽侧链、五肽交联桥。碱性染料初染液结晶紫（crystal violet）。媒染剂碘（iodine）。脱色剂95的酒精（ethanol）。复染液番红。固定时通过火焰12次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。（5）干燥和镜检：干燥后，置油镜观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌。血球计数板是由一块比普通载玻片厚的特制玻片制成的,