生产中常用菌种的分离选育和保藏

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,生产中常用菌种的分离、选育和保藏,主讲人：韩北忠,刘 萍,带图象分析系统的微生物菌种显微观察装置,第一节 菌种的分离简介,一、菌种的来源,根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；,从大自然中分离筛选新的微生物菌种。,二、分离思路,新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法，快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。,实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必须重新进行分离纯化。,有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合理先进的设备与之配合。,定方案：,首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。,采样：,有针对性地采集样品。,增殖：,人为地通过控制养分或培条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。,分离：,利用分离技术得到纯种。,发酵性能测定：,进行生产性能测定。这些特性包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、,最适,pH,值、提取工艺等。,三、新种分离与筛选的步骤,（,一）采样,1、采样对象,以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主，富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野果生长区和果园内。采样的对象也可以是植物，腐败物品，某些水域等。,从自然界筛选,2、采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。,3、采土方式：在选好适当地点后，用小萨子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。,（二）增殖培养,为了容易分离到所需的菌种，让无关的微生物至少是在数量上不要增加，可以通过配制选择性培养基，选择一定的培养条件来控制。,例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长，而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样对下阶段的纯种分离就会顺利得多。,（三）培养分离,尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。在这步，增殖培养的选择性控制条件还应进一步应用，而且控制得细一点，好一点。纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离法。,（,四,四,）,）,筛,筛,选,选,这,一,一,步,步,是,是,采,采,用,用,与,与,生,生,产,产,相,相,近,近,的,的,培,培,养,养,基,基,和,和,培,培,养,养,条,条,件,件,，,，,通,通,过,过,三,三,角,角,瓶,瓶,的,的,容,容,量,量,进,进,行,行,小,小,型,型,发,发,酵,酵,试,试,验,验,，,，,以,以,求,求,得,得,适,适,合,合,于,于,工,工,业,业,生,生,产,产,用,用,菌,菌,种,种,。,。,（,五,五,）,）,毒,毒,性,性,试,试,验,验,自,然,然,界,界,的,的,一,一,些,些,微,微,生,生,物,物,是,是,在,在,一,一,定,定,条,条,件,件,下,下,产,产,毒,毒,的,的,，,，,将,将,其,其,作,作,为,为,生,生,产,产,菌,菌,种,种,应,应,当,当,十,十,分,分,当,当,心,心,，,，,尤,尤,其,其,与,与,食,食,品,品,工,工,业,业,有,有,关,关,的,的,菌,菌,种,种,，,，,更,更,应,应,慎,慎,重,重,。,。,据,据,有,有,的,的,国,国,家,家,规,规,定,定,，,，,微,微,生,生,物,物,中,中,除,除,啤,啤,酒,酒,酵,酵,母,母,、,、,脆,脆,壁,壁,酵,酵,母,母,、,、,黑,黑,曲,曲,霉,霉,、,、,米,米,曲,曲,霉,霉,和,和,枯,枯,草,草,杆,杆,菌,菌,作,作,为,为,食,食,用,用,无,无,须,须,作,作,毒,毒,性,性,试,试,验,验,外,外,，,，,其,其,他,他,微,微,生,生,物,物,作,作,为,为,食,食,用,用,，,，,均,均,需,需,通,通,过,过,两,两,年,年,以,以,上,上,的,的,毒,毒,性,性,试,试,验,验,。,。,第,二,二,节,节,培,培,养,养,分,分,离,离,从,自,自,然,然,界,界,中,中,分,分,离,离,培,培,养,养,微,微,生,生,物,物,是,是,菌,菌,种,种,选,选,育,育,的,的,重,重,要,要,和,和,基,基,础,础,的,的,步,步,骤,骤,。,。,到,目,目,前,前,为,为,止,止,，,，,还,还,没,没,有,有,一,一,种,种,分,分,离,离,培,培,养,养,方,方,法,法,能,能,揭,揭,示,示,一,一,个,个,试,试,样,样,中,中,所,所,包,包,含,含,的,的,所,所,有,有,微,微,生,生,物,物,总,总,数,数,和,和,种,种,类,类,。,。,在,任,任,一,一,试,试,样,样,中,中,所,所,存,存,在,在,的,的,微,微,生,生,物,物,仅,仅,为,为,极,极,少,少,数,数,特,特,定,定,种,种,类,类,的,的,菌,菌,株,株,；,；,在,在,工,工,业,业,微,微,生,生,物,物,筛,筛,选,选,过,过,程,程,中,中,，,，,应,应,及,及,时,时,调,调,整,整,检,检,测,测,方,方,法,法,，,，,以,以,与,与,各,各,种,种,不,不,同,同,类,类,型,型,的,的,生,生,长,长,和,和,代,代,谢,谢,之,之,微,微,生,生,物,物,相,相,适,适,应,应,。,。,因,此,此,，,，,建,建,立,立,一,一,更,更,为,为,科,科,学,学,的,的,和,和,针,针,对,对,性,性,不,不,强,强,的,的,分,分,离,离,方,方,法,法,是,是,必,必,要,要,的,的,。,。,一,、,、,成,成,功,功,的,的,分,分,离,离,培,培,养,养,方,方,法,法,(1),认,认,真,真,考,考,它,它,所,所,需,需,产,产,品,品,的,的,特,特,征,征,和,和,生,生,产,产,过,过,程,程,；,；,(2),制,制,订,订,初,初,步,步,的,的,筛,筛,选,选,标,标,准,准,；,；,(3),将,将,生,生,态,态,学,学,方,方,法,法,运,运,用,用,到,到,分,分,离,离,和,和,筛,筛,选,选,过,过,程,程,。,。,二,、,、,培,培,养,养,分,分,离,离,中,中,要,要,解,解,决,决,的,的,问,问,题,题,1,、,、,“,“,分,分,离,离,什,什,么,么,和,和,从,从,哪,哪,里,里,分,分,离,离,出,出?,”,”,2,、,、,必,必,须,须,充,充,分,分,考,考,虑,虑,所,所,分,分,离,离,微,微,生,生,物,物,的,的,生,生,产,产,能,能,力,力,、,、,生,生,长,长,速,速,度,度,、,、,生,生,物,物,群,群,体,体,培,培,养,养,和,和,产,产,品,品,生,生,产,产,工,工,艺,艺,及,及,其,其,提,提,纯,纯,的,的,难,难,易,易,和,和,费,费,用,用,，,，,工,工,业,业,生,生,产,产,发,发,酵,酵,罐,罐,中,中,稳,稳,定,定,性,性,及,及,遗,遗,传,传,操,操,作,作,的,的,难,难,易,易,程,程,度,度,等,等,。,。,3,、,、,选,选,择,择,适,适,宜,宜,的,的,培,培,养,养,分,分,离,离,方,方,法,法,和,和,检,检,测,测,方,方,法,法,。,。,三,、,、,将,将,生,生,态,态,学,学,方,方,法,法,用,用,于,于,培,培,养,养,分,分,离,离,的,的,一,一,般,般,思,思,路,路,要,要,点,点,1,罗,罗,列,列,出,出,所,所,要,要,分,分,离,离,的,的,微,微,生,生,物,物,类,类,群,群,；,；,2,根,根,据,据,所,所,采,采,集,集,样,样,本,本,的,的,各,各,种,种,生,生,态,态,参,参,数,数,，,，,描,描,述,述,所,所,要,要,分,分,离,离,的,的,微,微,生,生,物,物,之,之,生,生,态,态,系,系,统,统,或,或,栖,栖,息,息,地,地,：,：,3,将,将,若,若,干,干,样,样,本,本,分,分,成,成,若,若,干,干,类,类,型,型,，,，,如,如,植,植,物,物,和,和,植,植,物,物,各,各,部,部,，,，,土,土,壤,壤(,类,类,型,型,和,和,土,土,层,层),、,、,岩,岩,石,石,、,、,水,水,、,、,昆,昆,虫,虫,和,和,发,发,酵,酵,食,食,品,品,等,等,；,；,4,罗,罗,列,列,出,出,所,所,要,要,考,考,察,察,和,和,测,测,量,量,的,的,环,环,境,境,参,参,数,数,，,，,如,如pH,、,、,盐,盐,分,分,、,、,水,水,分,分,、,、,氧,氧,化,化,还,还,原,原,电,电,势,势,及,及,温,温,度,度,等,等,；,；,5,列,列,出,出,生,生,物,物,系,系,统,统,中,中,有,有,用,用,的,的,自,自,然,然,底,底,物,物,，,，,如,如,森,森,林,林,土,土,壤,壤,中,中,的,的,几,几,丁,丁,质,质,、,、,葡,葡,萄,萄,表,表,皮,皮,的,的,果,果,胶,胶,；,；,6,根,根,据,据,上,上,述,述1-5,项,项,中,中,所,所,获,获,得,得,的,的,数,数,据,据,，,，,设,设,计,计,分,分,离,离,方,方,法,法,，,，,即,即,选,选,择,择,适,适,宜,宜,的,的,稀,稀,释,释,液,液,、,、,底,底,物,物,、,、,试,试,样,样,、,、,天,天,然,然,浸,浸,出,出,汁,汁,和,和,培,培,养,养,条,条,件,件,；,；,7用,标,标准方,法,法作对,照,照来评,价,价生态,学,学分离,方,方法；,8根,据,据待检,材,材料的,生,生态参,数,数需要,，,，修改,已,已知的,方,方法；,9运,用,用特定,的,的富集,方,方法，,富,富集那,些,些可能,具,具有筛,选,选意义,的,的微生,物,物类群,。,。,四、自,然,然界中,细,细菌的,分,分离,(一),采,采样和,采,采集方,法,法,为了从,一,一特定,生,生态系,统,统中分,离,离出具,有,有代表,性,性的细,菌,菌菌群,，,，特别,是,是分离,那,那些在,唯,唯一微,环,环境区,域,域中出,现,现的菌,群,群时，,必,必须十,分,分重视,样,样本的,采,采集。,样本采,集,集时所,需,需的工,具,具通常,有,有无菌,刮,刮铲、,土,土样采,集,集器、,镊,镊子、,解,解剖刀,、,、手套,、,、无菌,小,小塑料,袋,袋和塑,料,料瓶等,。,。,采样的,注,注意事,项,项,1、采,样,样时应,尽,尽可能,保,保持相,对,对无菌,；,；,2、所,采,采集的,样,样本必,须,须具有,某,某种代,表,表性；,3、采,好,好的样,必,必须完,整,整地标,上,上样本,的,的种类,及,及采集,日,日期、,地,地点以,及,及采集,地,地点的,地,地理、,生,生态参,数,数等；,4、应,充,充分考,虑,虑采样,的,的季节,性,性和时,间,间因素,，,，因为,真,真正的,原,原地菌,群,群的出,现,现可能,是,是短暂,的,的；,5、采,好,好的样,应,应及时,处,处理，,暂,暂不能,处,处理的,也,也应贮,存,存于4,下，,但,但贮存,时,时间不,宜,宜过长,。,。这是,因,因为一,旦,旦采样,结,结束，,试,试样中,的,的微生,物,物群体,就,就脱离,了,了原来,的,的生态,环,环境，,其,其内部,生,生态环,境,境就会,发,发生变,化,化，微,生,生物群,体,体之间,就,就会出,现,现消长,1土,样,样采集,方,方法,森林、,旱,旱地，,草,草地可,先,先掘洞,，,，由土,壤,壤下层,向,向上层,顺,顺序采,集,集；,水田等,浸,浸水土,壤,壤在不,损,损土层,结,结构的,情,情况下,插,插入圆,筒,筒采集,。,。如果,层,层次要,求,求不严,格,格，可,取,取离地,面,面515cm处的,土,土。将,采,采集到,的,的土样,盛,盛入聚,乙,乙烯袋,或,或玻璃,瓶,瓶中。,在采集,植,植物根,际,际土样,时,时，一,般,般方法,是,是自土,壤,壤中慢,慢,慢拔出,植,植物根,，,，在大,量,量无菌,水,水中浸,渍,渍约20min，洗,去,去粘附,在,在根上,的,的土壤,，,，然后,再,再用无,菌,菌水漂,洗,洗下根,部,部残留,的,的土，,这,这部分,上,上却为,根,根际土,样,样。,2植,物,物体采,集,集方法,在采集,叶,叶面时,，,，一般,是,是用灭,菌,菌的剪,刀,刀、打,孔,孔器、,安,安全刀,片,片等，,由,由几片,新,新鲜叶,片,片的同,一,一部位,切,切取一,小,小块，,并,并注意,不,不要损,伤,伤周围,边,边缘。,选择叶,面,面时应,考,考虑叶,位,位、叶,龄,龄、叶,片,片正反,面,面和在,一,一片叶,上,上的取,样,样部位,。,。,采集植,物,物根及,根,根系时,，,，方法,与,与根际,土,土样采,集,集方法,相,相似。,将,将洗净,的,的根装,入,入采样,袋,袋中，,采,采集根,系,系时，,一,一般与,根,根际土,样,样一起,保,保存。,3水,样,样采集,方,方法,用于细,菌,菌检测,的,的水样,应,应收集,于,于100m1,干,干净、,灭,灭菌的,广,广口塑,料,料瓶中,。,。,由于表,层,层水中,含,含有泥,沙,沙，故,在,在采样,时,时应在,较,较深的,静,静水层,中,中采集,水,水样。,方法是,：,：握住,采,采样瓶,底,底浸入,水,水中30-50cm,处,处，然,后,后瓶口,朝,朝下打,开,开瓶盖,，,，让水,样,样进入,。,。如果,有,有急流,存,存在的,话,话，应,直,直接将,瓶,瓶口反,向,向于急,流,流。采,集,集瓶从,水,水中取,出,出时应,迅,迅速并,带,带有较,大,大的弧,度,度。水,样,样不应,装,装满采,样,样瓶。,所,所有水,样,样都应,在,在24h之内,迅,迅速进,行,行检测,，,，或者4下,贮,贮存。,(二,),生态,学,学参,数,数及,培,培养,基,基,的,的组,成,成原,则,则,1、,加,加入,培,培养,基,基中,的,的天,然,然提,取,取物,种,种类,和,和用,量,量、,环,环境,生,生物,物,物理,学,学参,数,数以,及,及用,于,于平,板,板涂,布,布分,离,离样,本,本的,溶,溶剂,都,都会,影,影响,实,实验,中,中所,要,要分,离,离的,细,细菌,的,的数,量,量和,种,种类,。,。,2、,就,就分,离,离培,养,养基,的,的组,成,成而,言,言，,部,部分,培,培养,基,基中,必,必须,含,含有10-50%,的,的天,然,然提,取,取物,。,。加,入,入培,养,养基,中,中的,天,天然,提,提取,物,物，,部,部分,培,培养,基,基中,则,则应,含,含有,多,多种,碳,碳、,氮,氮源,，,，如,几,几丁,质,质、,纤,纤维,素,素或,果,果胶,。,。,3、,所,所有,分,分离,培,培养,基,基中,都,都应,含,含有,抗,抗真,菌,菌剂(如,放,放线,菌,菌酮,和,和制,霉,霉素)，,掺,掺加,浓,浓度,一,一般,为,为50gm1,，,，,以,以,抑,抑制,真,真菌,的,的生,长,长。,4、,琼,琼脂,平,平板,在,在使,用,用前,应,应置,于,于37,培,培养,箱,箱中,孵,孵育l、2天,。,。,5、,培,培养,基,基的,生,生物,物,物理,学,学参,数,数，,如,如pH及,盐,盐分,也,也应,调,调节,到,到与,试,试样,的,的生,态,态系,统,统参,数,数值,相,相近,。,。,土中,细,细菌,的,的富,集,集培,养,养与,分,分离,分离,土,土样,中,中的,大,大部,分,分细,菌,菌的,分,分离,程,程序,中,中无,需,需进,行,行富,集,集。,但对,某,某些,少,少数,细,细菌,则,则要,求,求特,殊,殊的,富,富集,或,或选,择,择技,术,术才,能,能很,好,好地,被,被分,离,离培,养,养。,富集,方,方法,运用,细,细菌,的,的酶,诱,诱导,性,性，,在,在分,离,离培,养,养基,中,中添,加,加若,干,干抗,生,生素,、,、复,杂,杂底,物,物及,生,生长,因,因子,的,的前,体,体物,质,质来,激,激活,细,细菌,某,某一,特,特殊,基,基因,组,组，,可,可以,建,建立,起,起若,干,干富,集,集技,术,术。,富集,可,可以,促,促进,抗,抗性,的,的产,生,生并,维,维持,下,下来,。,。,土样,中,中细,菌,菌的,富,富集,：,：适,度,度稀,释,释后,，,，取0.1m1涂,布,布已,添,添加,及,及未,添,添加,富,富集,底,底物(如,几,几丁,质,质、,纤,纤维,素,素等)的,土,土浸,出,出汁,平,平板,。,。,植物,体,体上,细,细菌,的,的分,离,离：,无,无菌,富,富集,，,，加,植,植物,浸,浸出,液,液适,度,度培,养,养取,样,样，,洗,洗涤,，,，取1ml经,适,适度,稀,稀释,后,后涂,布,布平,板,板。,水中,细,细菌,的,的分,离,离：,水,水样,通,通过0.22,m,无,无菌,滤,滤膜,，,，取,出,出滤,膜,膜用1ml无,菌,菌稀,释,释液,将,将滤,膜,膜上,的,的沉,积,积洗,下,下。,用,用样,本,本稀,释,释液,适,适度,稀,稀释,涂,布,布平,板,板倒,置,置培,养,养或,滤,滤纸,压,压印,分,分离,法,法。,水中,细,细菌,分,分离,的,的简,易,易富,集,集技,术,术,在无,菌,菌的,、,、用,棉,棉团,塞,塞好,的,的广,口,口三,角,角烧,瓶,瓶中,连,连续,培,培养,，,，定,期,期取,样,样涂,布,布适,宜,宜分,离,离琼,脂,脂平,板,板上,；,；,在不,同,同水,体,体的,水,水样,中,中加,入,入一,定,定的,底,底物,如,如蔗,糖,糖、,多,多糖,及,及蛋,白,白质,等,等，,同,同样,可,可以,促,促进,水,水中,微,微生,物,物的,增,增殖,。,。,培养,过,过程,中,中可,加,加入,低,低浓,度,度的,抗,抗真,菌,菌剂,以,以抑,制,制真,菌,菌的,生,生长,。,。,另一,富,富集,方,方法,是,是在,培,培养,烧,烧瓶,中,中添,加,加细,菌,菌“,附,附着,材,材料,”,”，,如,如无,菌,菌的,植,植物,组,组织,或,或土,壤,壤浸,出,出液,。,。,通过,改,改变,培,培养,温,温度,和,和培,养,养周,期,期可,选,选择,性,性富,集,集嗜,冷,冷性,细,细菌,、,、中,温,温菌,和,和嗜,高,高温,菌,菌。,次代,培,培养,及,及纯,化,化步,骤,骤,1、,涂,涂布,的,的平,板,板经,培,培养,后,后，,如,如生,长,长出,菌,菌落,，,，则,按,按涂,布,布不,同,同稀,释,释度,的,的稀,释,释液,所,所得,的,的单,菌,菌菌,落,落和,多,多菌,菌,菌落,对,对琼,脂,脂平,板,板进,行,行分,类,类。,2、,用,用无,菌,菌牙,签,签将,菌,菌落,转,转接,到,到筛,选,选平,板,板上,及,及转,接,接至,添,添加,有,有少,量,量天,然,然浸,出,出液,的,的适,宜,宜保,藏,藏琼,脂,脂斜,面,面上,。,。,3、,筛,筛选,平,平板,经,经培,养,养后,，,，按,生,生长,出,出菌,落,落的,形,形态,学,学特,征,征如,色,色素,、,、菌,落,落形,态,态等,进,进行,最,最初,分,分组,。,。,4、,将,将认,为,为有,希,希望,的,的菌,落,落用,牙,牙签,转,转接,到,到另,一,一模,拟,拟分,离,离琼,脂,脂平,板,板上,进,进行,筛,筛选,。,。,五、,放,放线,菌,菌的,分,分离,(一)采,样,样及,采,采集,方,方法,应尽,可,可能,实,实行,无,无菌,操,操作,。,。,所采,集,集的,样,样本,应,应具,有,有一,定,定的,代,代表,性,性。,样本,采,采集,完,完后,，,，应,及,及时,处,处理,或,或在4,下,下贮,存,存，,贮,贮存,试,试样,处,处应,与,与划,线,线，,筛,筛选,平,平板,分,分开,，,，贮,存,存时,间,间不,宜,宜过,长,长。,(二)生,态,态学,参,参数,放线,菌,菌分,离,离培,养,养过,程,程中,所,所需,考,考虑,的,的生,态,态参,数,数有,温,温度,、,、pH、,离,离子,强,强度,、,、氧,化,化还,原,原电,势,势和,底,底物,浓,浓度,。,。,（三,）,）培,养,养基,的,的组,成,成原,则,则,大多,数,数放,线,线菌,的,的分,离,离培,养,养是,在,在贫,脊,脊或,复,复杂,底,底物,的,的琼,脂,脂平,板,板上,进,进行,的,的。,除,除嗜,温,温性,放,放线,菌,菌外,，,，其,他,他放,线,线菌,一,一般,在,在培,养,养4-20天,内,内在,分,分离,平,平板,上,上缓,慢,慢形,成,成菌,落,落。,在放,线,线菌,分,分离,琼,琼脂,中,中通,常,常都,加,加入,抗,抗真,菌,菌剂,制,制霉,菌,菌素,或,或放,线,线菌,酮,酮，,以,以抑,制,制真,菌,菌的,繁,繁殖,。,。,选择,性,性地,添,添加,抗,抗生,素,素。,分离,琼,琼脂,平,平板,制,制备,好,好后,，,，一,般,般皆,应,应在37,培,养,养箱,中,中存,放,放3,天,天。,放线,菌,菌的,分,分离,土样,中,中放,线,线菌,的,的非,选,选择,性,性分,离,离：,土,土样,风,风干,，,，磨,碎,碎，,无,无菌,海,海绵,压,压印,土,土样,后,后压,印,印平,板,板后,培,培养,。,。,植物,体,体上,放,放线,菌,菌的,分,分离,：,：无,菌,菌取,植,植物,组,组织,，,，干,燥,燥以,减,减少,细,细菌,数,数量,，,，剪,碎,碎植,物,物材,料,料后,植,植入,平,平板,表,表层,后,后培,养,养。,也,也可,洗,洗下,微,微生,物,物后,振,振荡,培,培养,。,。,水中,放,放线,菌,菌的,分,分离,：,：,为,为使,所,所要,分,分离,的,的放,线,线菌,的,的数,量,量种,类,类增,多,多，,一,一般,将,将水,样,样离,心,心或,滤,滤纸,过,过滤,，,，取,离,离心,沉,沉积,或,或滤,纸,纸表,面,面沉,积,积进,行,行系,列,列稀,释,释和,涂,涂布,。,。,次代,培,培养,及,及纯,化,化,菌落,形,形成,后,后可,根,根据,肉,肉眼,可,可见,的,的菌,落,落形,态,态上,的,的差,异,异，,作,作初,步,步的,鉴,鉴定,和,和区,分,分。,通过,高,高倍,放,放大,进,进行,镜,镜检,，,，可,了,了解,气,气生,和,和营,养,养孢,子,子形,成,成情,况,况。,成功,地,地分,离,离出,各,各种,不,不同,的,的放,线,线菌,属,属及,种,种的,关,关键,是,是所,采,采集,样,样本,的,的本,身,身及,其,其分,离,离用,的,的琼,脂,脂培,养,养基,；,；而,肉,肉眼,识,识别,不,不同,的,的生,长,长形,态,态、,从,从而,初,初步,地,地加,以,以鉴,定,定，,在,在分,离,离放,线,线菌,时,时显,得,得尤,为,为重,要,要。,将分,离,离平,板,板上,所,所形,成,成的,菌,菌落,用,用经,火,火焰,灼,灼烧,灭,灭菌,的,的钩,形,形针,或,或无,菌,菌牙,签,签挑,取,取，,点,点接,到,到琼,脂,脂平,板,板上,进,进行,影,影印,培,培养,，,，以,进,进一,步,步筛,选,选和,分,分离,。,。,六,、真,菌,菌分,离,离,1、,利,利用,低,低碳,氮,比,比的,培,培养,基,基可,使,使真,菌,菌生,长,长菌,落,落分,散,散，,利,利于,计,计数,，,，分,离,离和,鉴,鉴定,。,。这,里,里主,要,要是,利,利用,营,营养,成,成分,的,的减,少,少而,使,使生,长,长减,慢,慢，,并,并由,此,此限,制,制真,菌,菌的,迁,迁涉,生,生长,。,。,2、,改,改变,培,培养,温,温度,将,将有,利,利于,不,不同,嗜,嗜温,区,区真,菌,菌的,分,分离,。,。,3、,有,有时,，,，真,菌,菌子,实,实体,形,形成,必,必须,有,有光,线,线，,这,这在,分,分离,培,培养,时,时应,加,加以,考,考虑,。,。,4、,选,选择,性,性富,集,集：,是,是通,过,过一,定,定的,方,方式,使,使样,本,本中,一,一种,或,或一,群,群微,生,生物,数,数量,上,上的,增,增加,而,而利,于,于分,离,离的,一,一种,技,技术,。,。,富集,可,可以,是,是种,水,水平,的,的，,如,如通,过,过营,养,养要,求,求的,改,改变,来,来富,集,集分,离,离镰,刀,刀菌,；,；也,可,可以,是,是组,成,成群,水,水平,的,的，,如,如以,纤,纤维,素,素为,唯,唯一,碳,碳源,的,的选,择,择性,培,培养,基,基可,选,选择,性,性富,集,集所,有,有能,降,降解,纤,纤维,素,素的,纤,纤维,素,素裂,解,解微,生,生物,。,。,5、,选,选择,性,性抑,制,制培,养,养基,可,可使,非,非目,标,标微,生,生物,消,消除,或,或减,少,少到,一,一定,程,程度,。,。在,分,分离,培,培养,基,基中,加,加入,一,一定,的,的抗,生,生素,即,即可,有,有效,地,地抑,制,制细,菌,菌生,长,长及,菌,菌落,形,形成,。,。,真菌,的,的分,离,离方,法,法,土中,真,真菌,的,的分,离,离：,稀,稀释,法,法，,混,混入,法,法，,压,压贴,法,法，,粘,粘附,法,法，,浮,浮选,法,法，,注,注射,器,器采,集,集法,，,，土,过,过筛,法,法，,庶,庶糖,密,密度,梯,梯度,离,离心,法,法。,植物,材,材料,中,中真,菌,菌的,分,分离,：,：植,入,入法,，,，压,贴,贴法,，,，洗,涤,涤法,，,，浸,泡,泡法,。,。,水中,真,真菌,的,的分,离,离：,水,水样,稀,稀释,后,后涂,布,布分,离,离。,饵,饵诱,技,技术,常,常用,于,于水,中,中真,菌,菌的,富,富集,。,。,子实,体,体直,接,接分,离,离培,养,养担,子,子菌,：,：新,采,采集,的,的子,实,实体,组,组织,植,植入,平,平板,内,内或,在,在放,于,于液,体,体培,养,养基,表,表面,放,放一,小,小块,无,无菌,滤,滤纸,上,上培,养,养。,七、,生,生产,选,选种,是在,长,长年,累,累月,的,的生,产,产实,践,践中,，,，在,培,培养,工,工艺,条,条件,没,没有,任,任何,可,可见,变,变更,情,情况,下,下，,突,突然,发,发现,某,某些,批,批次,生,生产,水,水平,提,提高,较,较大,，,，这,就,就有,可,可能,是,是个,别,别自,然,然变,异,异朝,更,更好,的,的方,向,向变,的,的细,胞,胞，,在,在这,种,种条,件,件下,很,很适,应,应于,培,培养,条,条件,，,，并,逐,逐渐,显,显示,出,出它,的,的生,长,长优,势,势，,这,这种,优,优势,的,的发,展,展，,促,促使,它,它优,良,良的,生,生产,性,性能,表,表露,。,。进,行,行类,似,似新,种,种筛,选,选分,离,离，,达,达到,获,获得,新,新的,优,优良,生,生产,菌,菌种,的,的目,的,的。,第三,节,节,工,工,业,业菌,种,种的,育,育种,方,方针,工业,菌,菌种,的,的育,种,种：,是运,用,用遗,传,传学,原,原理,和,和技,术,术对,某,某个,用,用于,特,特定,生,生物,技,技术,目,目的,的,的菌,株,株进,行,行的,多,多方,位,位的,改,改造,。,。通,过,过改,造,造，,可,可使,现,现存,的,的优,良,良性,状,状强,化,化，,或,或去,除,除不,良,良性,质,质或,增,增加,新,新的,性,性状,。,。,工业,菌,菌种,育,育种,的,的方,法,法,诱变,基因,转,转移,基因,重,重组,育种,过,过程,包括,下,下列3个,步,步骤,：,：,(1)在,不,不影,响,响菌,种,种活,力,力的,前,前提,下,下，,有,有益,基,基因,型,型的,引,引入,。,。,(2)希,望,望基,因,因型,的,的选,出,出。,(3)改,良,良菌,种,种的,评,评价(包,括,括实,验,验规,模,模和,工,工业,生,生产,规,规模)。,选择,育,育种,方,方法,时,时综,合,合考,虑,虑的,因,因素,(1)待,改,改良,性,性状,的,的本,质,质及,与,与发,酵,酵工,艺,艺的,关,关系(如,批,批式,或,或连,续,续发,酵,酵试,验,验),；,；,(2)对,这,这一,特,特定,菌,菌种,的,的遗,传,传和,生,生物,化,化学,万,万面,认,认识,的,的明,了,了程,度,度；,(3)经,济,济费,用,用。,如果,对,对特,定,定菌,种,种的,基,基本,性,性状,及,及其,工,工艺,知,知晓,甚,甚少,，,，则,多,多半,采,采用,随,随机,诱,诱变,、,、筛,选,选及,选,选育,等,等技,术,术：,如果,对,对其,遗,遗传,及,及生,物,物化,学,学方,面,面的,性,性状,已,已有,较,较深,的,的认,识,识，,则,则可,选,选择,基,基因,重,重组,等,等手,段,段进,行,行定,向,向育,种,种。,工业,菌,菌种,改,改良,方,方法,(1)解,除,除或,绕,绕过,代,代谢,途,途径,中,中的,限,限速,步,步骤,：,：通,过,过增,加,加特,定,定基,因,因的,拷,拷贝,数,数或,增,增加,相,相应,基,基因,的,的表,达,达能,力,力来,提,提高,限,限速,酶,酶的,含,含量,；,；在,代,代谢,裔,裔途,径,径中,引,引伸,出,出新,的,的代,谢,谢步,骤,骤，,由,由此,提,提供,一,一个,旁,旁路,代,代谢,途,途径,。,。,(2)增,加,加前体物,的,的浓度。,(3)改,变,变代谢途,径,径，减少,无,无用副产,品,品的生成,以,以及提高,菌,菌种对高,浓,浓度的有,潜,潜在毒性,的,的底物、,前,前体或产,品,品的耐受,力,力。,(4)抑,制,制或消除,产,产品分解,酶,酶。,(5)改,进,进菌种外,泌,泌产品的,能,能力。,(6)消,除,除代谢产,品,品的反馈,抑,抑制。如,诱,诱导代谢,产,产品的结,构,构类似物,抗,抗性。,提高特定,基,基因的表,达,达水平,(1)引,入,入强转录,及,及翻译信,号,号，可通,过,过在一高,效,效表达载,体,体上克隆,靶,靶基因；,在,在靶基因,的,的上游引,入,入强启动,子,子；修改,现,现有表达,信,信号，提,高,高基因效,力,力等。,(2)诱,导,导解除基,因,因表达抑,制,制的突变,。,。,改进菌种,的,的生长效,率,率,提高菌株,对,对底物的,利,利用率方,法,法：,a.,通,通过确定,并,并改变代,谢,谢中的耗,能,能部分;,b. 由,另,另一菌株,的,的高效低,能,能代谢途,径,径代谢来,实,实现。,c. 赋,予,予菌种对,多,多种底物,，,，特别是,价,价廉而丰,富,富的底物,的,的利用能,力,力，由此,可,可降低操,作,作费用。,第四节,诱,诱变育,种,种,以微生物,的,的自然变,异,异作为基,础,础的生产,选,选种的机,率,率并不很,高,高，一个,基,基因的自,然,然突变频,率,率仅10-6-10-10,左,左右。,诱变育种,：,：以诱发,突,突变为基,础,础的育种,，,，是迄今,为,为止国内,外,外提高菌,种,种产量、,性,性能的主,要,要手段。,诱变,物理、化,学,学或生物,诱,诱变方法,一、诱变,剂,剂和诱变,处,处理,物理诱变,剂,剂：射线,如,如紫外线,、,、X射,线,线、,射,射线，快,中,中子；,物理因素,中,中目前使,用,用得最方,便,便而且十,分,分有效的,是,是紫外线,。,。许多高,产,产菌株的,选,选育都用,过,过紫外线,，,，对于一,般,般实验室,、,、中小型,工,工厂都适,用,用，也很,安,安全。,其他的几,种,种射线都,是,是电离性,质,质的，有,一,一定的穿,透,透力，一,般,般都由专,业,业人员在,专,专门的设,备,备中使用,，,，否则有,一,一定危险,性,性。,化学诱变,剂,剂：,化学因子,如,如碱基类,似,似物、5,氟尿嘧,啶,啶、烷化,剂,剂等。,化学诱变,剂,剂中使用,最,最多、最,有,有效的是,烷,烷化剂。,使用化学,诱,诱变剂的,优,优缺点：,1、大多,数,数情况下,，,，就突变,数,数量而言,，,，要比电,离,离辐射更,有,有效。,2、化学,诱,诱变剂是,很,很经济的,，,，因为只,需,需要少量,的,的合适的,诱,诱变剂，,设,设备是实,验,验室的一,般,般玻璃器,皿,皿，一个,蒸,蒸气罩。,而,而用电离,辐,辐射行,工,工作时，,设,设备费用,大,大，并要,注,注意安全,性,性。,3、大部,分,分诱变剂,是,是致癌剂,，,，所以在,使,使用中必,须,须非常谨,慎,慎，要避,免,免化学诱,变,变剂与皮,肤,肤接触，,，,，且切勿,吸,吸入其蒸,气,气，有人,对,对某些诱,变,变剂极其,敏,敏感，甚,至,至未直接,接,接触就会,过,过敏，这,就,就更要当,心,心。,诱变剂的,选,选择,1碱基,类,类似物和,羟,羟胺具有,很,很高的特,异,异性，但,很,很少使用,，,，回复突,变,变率高，,效,效果不大,。,。,2亚硝,酸,酸和烷化,剂,剂应用的,范,范围较广,，,，造成的,遗,遗传损伤,较,较多。其,中,中亚硝基,胍,胍和甲基,磺,磺酸乙酯,常,常被称为,“,“超诱变,剂,剂”，甲,基,基磺酸乙,酯,酯是毒性,最,最小的诱,变,变剂之一,。,。,3吖啶,类,类诱变剂,可,可以造成,生,生化代谢,途,途径的完,全,全中断。,4紫外,线,线仍十分,有,有效。电,离,离辐射是,造,造成染色,体,体巨大损,伤,伤的最好,诱,诱变剂，,它,它能造成,不,不可回复,的,的缺突变,。,。但它可,能,能影响邻,近,近基因的,性,性能。,二、诱变,育,育种步骤,出发菌株,的,的选择,处理菌悬,液,液的制备,诱变处理,中间培养,分离和筛,选,选,(一)出,发,发菌株的,选,选择,1自然,界,界新分离,的,的野生型,菌,菌株，对,诱,诱变处理,较,较敏感，,容,容易达到,好,好的效果,。,。,2在生,产,产中经生,产,产选种得,到,到的菌株,与,与野生型,较,较相像，,也,也是良好,的,的出发菌,株,株。,3每次,诱,诱变处理,都,都有一定,提,提高的菌,株,株，往往,多,多次诱变,能,能积累较,多,多的提高,。,。,4出发,菌,菌株开始,时,时可以同,时,时选23株，在,处,处理比较,后,后，将更,适,适合的出,发,发菌株留,作,作继续诱,变,变。,5要尽,量,量选择单,倍,倍体细胞,、,、单核或,核,核少的多,细,细胞体来,作,作出发诱,变,变细胞，,这,这是由于,变,变异性状,大,大部分是,隐,隐性的，,特,特别是高,产,产基因。,6根据,采,采用的诱,变,变剂或根,据,据细胞生,理,理状态或,诱,诱变谱选,择,择诱变剂,，,，因为同,一,一诱变剂,的,的重复处,理,理会使细,胞,胞产生抗,性,性，使诱,变,变效果下,降,降。有的,诱,诱变剂是,作,作用于营,养,养细胞，,就,就要选对,数,数期的细,胞,胞：有的,作,作用于休,止,止期，就,可,可选用孢,子,子。,(二)处,理,理菌悬液,的,的制备,这一步骤,的,的关键是,制,制备单细,胞,胞和单孢,子,子状态的,、,、活力类,似,似的菌悬,液,液，为此,要,要进行合,适,适培养基,的,的培养，,并,并要离心,，,，洗涤，,过,过滤。,(三)诱,变,变处理,根据前面,有,有关诱变,剂,剂及诱变,处,处理的介,绍,绍，结合,诱,诱变对象,的,的实际，,设,设计诱变,处,处理方案,。,。,(四)中,间,间培养,由于在发,生,生了突变,尚,尚未表现,出,出来之前,，,，有一个,表,表现延迟,的,的过程，,即,即细胞内,原,原有酶量,的,的稀释过,程,程(生理,延,延迟)，,需,需3代以,上,上的繁殖,才,才能将突,变,变性状表,现,现出来。,这,这个过程,对,对今后的,筛,筛选和获,得,得稳定菌,株,株都是极,为,为重要的,。,。,方法：,让变异处,理,理后细胞,在,在液体培,养,养基中培,养,养几小时,，,，以让细,胞,胞的遗传,物,物质复制,，,，让细胞,繁,繁殖几代,，,，以得到,纯,纯的变异,细,细胞。这,样,样，隐性,的,的变异就,会,会显现出,来,来，若不,经,经液体培,养,养基的中,间,间培养，,直,直接在平,皿,皿上分离,就,就会出现,变,变异和不,变,变异细胞,同,同时存在,于,于一个菌,落,落内的可,能,能，形成,混,混杂菌落,，,，以致造,成,成筛选结,果,果的不稳,定,定和将来,的,的菌株退,化,化。,(五)分,离,离和筛选,筛选分初,筛,筛和复筛,。,。初筛以,迅,迅速筛出,大,大量的达,到,到初步要,求,求的分离,菌,菌落为目,的,的，以量,为,为主。,复筛则是,精,精选，以,质,质为主，,也,也就是以,精,精确度为,主,主。因此,在,在具体方,法,法上就有,差,差异.,例如初筛,可,可以在平,皿,皿上直接,以,以菌落的,代,代谢产物,与,与某些染,料,料或基质,的,的作用形,成,成的变色,圈,圈或透明,圈,圈的大小,来,来挑取参,加,加复筛者,，,，而将90%的菌,落,落淘汰。,在,在数量减,少,少后就要,仔,仔细比较,参,参加复筛,和,和再复筛,的,的菌株，,最,最后才能,选,选得优秀,菌,菌株。在,以,以后的复,筛,筛阶段，,还,还应不断,结,结合自然,分,分离，纯,化,化菌株。,紫外线的,诱,诱变育种,紫外线诱,变,变一般采,用,用15W,紫,紫外线杀,菌,菌灯，波,长,长为2537A,灯,灯与处理,物,物的距离,为,为1530cm,，,，照射时,间,间依菌种,而,而异，一,般,般为几秒,至,至几十分,钟,钟。一般,我,我们常以,细,细胞的死,亡,亡率表示,，,，希望照,射,射的剂量,死,死亡率控,制,制在70,80%,为,为宜。,被照射的,菌,菌悬液细,胞,胞数，细,菌,菌为106个ml左右，,霉,霉菌孢子,和,和酵母细,胞,胞为106107个ml。由于,紫,紫外线穿,透,透力不强,，,，要求照,射,射液不要,太,太深，约0.51.0cm厚，同,时,时要用电,磁,磁搅拌器,或,或手工进,行,行搅拌，,使,使照射均,匀,匀。,由于紫外,线,线照射后,有,有光复活,效,效应，所,以,以照射时,和,和照射后,的,的处理应,在,在红灯下,进,进行。,(二)操,作,作步骤,1将细,菌,菌培养液,以,以3000rmin离心5min,，,，倾去上,清,清液，将,菌,菌体打散,加,加入无菌,生,生理盐水,再,再离心洗,涤,涤。,2将菌,悬,悬液放入,一,一巳灭菌,的,的，装有,玻,玻璃珠的,三,三角瓶内,用,用手摇动,，,，以打散,菌,菌体。将,菌,菌液倒入,有,有定性滤,纸,纸的漏斗,内,内过滤，,单,单细胞滤,液,液装入试,管,管内，一,般,般处于浑,浊,浊态的细,胞,胞液含细,胞,胞数可达108个,ml左,右,右，作为,待,待处理菌,悬,悬液。,3取2,4m1,制,制备的菌,液,液加到直,径,径9cm,培,培养皿内,，,，放入一,无,无菌磁力,搅,搅拌子，,然,然后置磁,力,力搅拌器,上,上、15W紫外线,下,下30cm处。在,正,正式照射,前,前，应先,开,开紫外线10min，让紫,外,外灯预热,，,，然后开,启,启皿盖正,式,式在搅拌,下,下照射1050s。操作,均,均应在红,灯,灯下进行,，,，或用黑,纸,纸包住，,避,避免白炽,光,光。,4取未照,射,射的制备菌,液,液和照射菌,液,液各o.5ml进行稀,释,释分离，计,数,数活菌细胞,数,数。,5取照射,菌,菌液2ml,于,于液体培养,基,基中(300ml三角,瓶,瓶内装30ml培养液)，120rmin,振,振荡培养4,6h。,6取中间,培,培养液稀释,分,分离、培养,。,。,7挑取菌,落,落进行筛选,。,。,亚硝基胍诱,变,变曲霉菌,N甲基N-硝基-N-亚硝,基,基胍(NGN，MNNG或TG),对,对真核或原,核,核微生物都,有,有强烈的诱,变,变作用。其,精,精确的作用,机,机制尚不很,清,清楚，据认,为,为是伴随着,重,重氮甲烷的,生,生成及在酸,性,性条件下生,成,成亚硝酸，,直,直接作用于,细,细胞内的DNA复制系,统,统，从而诱,发,发了变异。MNNG的,诱,诱变作用随pH的升高,而,而增强。,(二)操作,步,步骤,1单孢子,悬,悬液制备,取,取斜面，,加,加入6ml0.1molLpH6.o,的,的磷酸缓冲,液,液，用接种,环,环刮下孢子,，,，振荡试管,，,，立即通过,带,带滤纸漏斗,过,过滤，由此,制,制得单孢子,悬,悬液，若孢,子,子液浑浊状,，,，其孢子浓,度,度可达l06个ml,，,，此为待处,理,理孢子悬液,。,。,2MNNG溶液的制,备,备 用分,析,析天平称取2mg，加,入,入2ml0.1molL pH 6.0,磷,磷酸缓冲液,，,，于暗处振,荡,荡溶解。,3诱变处,理,理 吸取MNNG溶,液,液lml，,加,加入到1m1孢子悬液,中,中，30,振,振荡30min，立即,稀,稀释1000倍停止作,用,用，然后以10-2，10-4两,个,个稀释度分,离,离培养，30 3天,后,后计数。,4死亡率,计,计算 将,未,未处理的孢,子,子液1ml,加,加入1ml,磷,磷酸缓冲液,中,中，同上逐,级,级稀释分离,，,， 30,下培养3,天,天。根据处,理,理前后的活,孢,孢子数可计,算,算出死亡率,。,。,5挑取菌,落,落进行糖化,酶,酶及蛋白酶,产,产量筛选,第五节,营,营养缺陷型,的,的选育,营养缺陷型,是,是指通过诱,变,变而产生的,缺,缺乏合成某,些,些营养物质,如,如氨基酸、,维,维生素和碱,基,基等的能力,，,，必须在其,基,基本培养基,中,中加入相应,的,的营养成分,才,才能正常生,长,长的变异株,。,。,与营养缺陷,型,型对应的是,野,野生型。,能满足野生,型,型菌株正常,生,生长的培养,基,基称基本培,养,养基(MM)；,在基本培养,基,基中加入相,应,应的营养成,分,分的称补充,培,培养基(SM)；,能满足各种,营,营养缺陷型,生,生长的称完,全,全培养基(CM)，如,牛,牛肉膏蛋白,胨,胨培养基、,麦,麦芽汁培养,基,基等。,营养缺陷型,的,的用途,营养缺陷型,在,在生产上和,科,科学研究上,用,用途很大。,目,目前生产氨,基,基酸、核苷,酸,酸的菌种都,是,是各种类型,的,的缺陷型。,要,要研究代谢,途,途径，育种,技,技术都必须,有,有营养缺陷,型,型的菌株为,材,材料。,筛选营养缺,陷,陷型的步骤,诱变,淘汰野生型,检出缺陷型,确定生长谱,一、诱变方,法,法,物理诱变,化学诱变,二、淘汰野,生,生型,抗生素法：,野,野生型能在MM中生长,，,，而缺陷型,不,不能，于是,将,将诱变处理,液,液在MM中,培,培养短时让,野,野生型生长,，,，处于活化,阶,阶段，而缺,陷,陷型无法生,长,长，仍处于,休,休眠状态。,由,由于细菌或,酵,酵母对一些,抗,抗生素敏感,，,，于是就相,应,应加入一定,量,量的抗生素,，,，结果活化,状,状态的野生,型,型就被杀死,，,，保存了缺,陷,陷型。一般,细,细菌可以采,用,用青霉素，,酵,酵母可采用,制,制霉菌素。,菌丝过滤法,：,：对于霉菌,，,，因孢子生,长,长后会长出,菌,菌丝体，就,可,可用滤纸过,滤,滤法将菌丝,滤,滤去，而缺,陷,陷型孢子却,因,因未发芽而,不,不能滤过。,三、检出缺,陷,陷型,原理：在固,体,体基本培养,基,基和完全培,养,养基上，生,长,长情况完全,不,不同，缺陷,型,型在CM上,生,生长良好，,而,而在MM上,则,则不生长，,野,野生型都能,生,生长。,具体方法：,影,影印法、点,种,种法、夹层,法,法,1将一较,平,平皿直径小1cm的金,属,属圆筒蒙上,一,一层灭菌的,丝,丝绒，用金,属,属夹夹住，,灭,灭菌。,2将完全,培,培养基上长,出,出的全部菌,落,落在丝绒上,轻,轻轻一压，,使,使之成为印,模,模，标记方,位,位。,3将基本,培,培养基平皿,和,和完全培养,基,基平皿在标,记,记的同一方,位,位上先后轻,轻,轻一压，此,菌,菌印模即复,印,印于上。,(一)影印,法,法,4 将CM和MM在,恒,恒温箱中培,养,养。,5二平皿,相,相同方位进,行,行比较，,即,即可发现,在,在MM平皿,上,上长出的菌,落,落少于GM,平,平板上的。MM上未长,而,而相应于CM上长出的,那,那几个菌落,就,就可能是缺,陷,陷型。,此法要求平,皿,皿上菌落不,能,能太多，菌,落,落之间应有,一,一定间隔。,(二)点种,法,法,也就是任意,法,法。,用接种针或,牙,牙签将CM,上,上长出的菌,落,落在MM和CM两副平,板,板上接种，,依,依次在相应,位,位置点种，,然,然后一起培,养,养，观察其,生,生长情况。,此法结果明,确,确，但工作,量,量大。,(三)夹层,法,法,先在培养皿,上,上倒一层基,本,本琼脂培养,基,基，凝固后,涂,涂上一层含,菌,菌的MM，,凝,凝固后再倒,一,一薄层MM,琼,琼脂培养基,，,，培养24h，将出现,的,的菌落标记,，,，然后倒上,一,一层CM琼,脂,脂培养基，,再,再培养。这,时,时第二批长,出,出的菌落就,可,可能是缺陷,型,型。,此法缺点是,，,，结果有时,不,不明确，而,且,且将缺陷型,菌,菌落从夹层,中,中挑出并不,很,很容易。,四、营养缺,陷,陷型生长谱,的,的确定,验证确定是,缺,缺陷型后，,就,就需确定其,缺,缺陷的因子,，,，即生长谱,测,测定。,生长谱测定,的,的方法,将缺陷型菌,株,株培养后，,收,收集菌体，,制,制备成细胞,悬,悬液，与MM培养基(,融,融化并凉至50)混,合,合并倾注平,皿,皿。待凝固,后,后，分别在,平,平皿的56个区间放,上,上不同的营,养,养组合的混,合,合物或吸饱,此,此组合营养,物,物的滤纸圆,片,片。培养后,会,会在某组合,区,区长出，就,可,可测得所需,营,营养。个,平,平皿测一个,菌,菌。,以不同组合,的,的营养混合,物,物与融化凉,至,至50的MM培养基,混,混合铺成平,皿,皿，然后在,这,这些平皿上,划,划线接种各,个,个缺陷型菌,株,株于各相应,位,位置，培养,后,后根据在这,些,些组合长出,可,可推知其营,养,养因子。在56个平,皿,皿上可测20株菌以上,。,。,第六节,基,基因育种,基因重组育,种,种：是运用,体,体外DNA,各,各种操作或,修,修改手法获,得,得目的基因,，,，再借助于,病,病毒、细菌,质,质粒或其他,载,载体，将目,的,的基因转移,至,至新的宿主,细,细胞并使其,在,在新的宿主,细,细胞系统内,进,进行复制和,表,表达，或者,通,通过细胞间,的,的相互作用,，,，使一个细,胞,胞的优秀性,状,状经其间遗,传,传物质的交,换,换而转移给,另,另个细胞,的,的方法。,一个完整的,基,基因克隆过,程,程包括以下,步,步骤,、获得待,克,克隆的D