课题3　血红蛋白的提取和分离 (12)(精品)

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,思考：,1,、血红蛋白为什么呈现,红色,？,2,、一分子血红蛋白可携带几分子,O,2,？,3,、一分子血红蛋白可携带几分子,CO,2,？,血红蛋白,专题,5 DNA,和蛋白质技术,1.,蛋白质分离的原理：,根据蛋白质,各种特性,的差异，如,分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力,等等，可以用来分离,不同种类,的蛋白质。,一、,基础知识,（一）凝胶色谱法（,分配色谱法,）,2.,凝胶：,大多数凝胶是由,多糖类化合物,（如,葡聚糖或琼脂糖,）构成的,多孔,小球体，,内部有许多贯穿的,通道,。,琼脂糖：用琼脂为原料经加工精制的大分子凝胶,根据被分离物质的蛋白质,相对分子质量,的大小，利用具有,网状结构,的凝胶，来进行分离。,1.,概念：,洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，,促使蛋白质分子的差速流动。,混合物,上 柱,洗,脱,大分子流动快,小分子流动慢,收 集,大分子,收 集,小分子,4.,凝胶色谱法的原理,相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢,;,相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。,相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。,进行体外实验时，如何保证蛋白质不会发生变性呢？,（二）缓冲溶液,能够抵制,外界的酸和碱,对溶液,PH,值,的影响，,维持,PH,基本不变。,1.,作用,:,2.,缓冲溶液的配制,:,通常由,1,2,种缓冲剂,溶解于水,中配制而成。调节缓冲剂的,使用比例,就可以制得在,不同,PH,范围内,使用的缓冲液。,3,.,在本课题中使用的缓冲液是,:,磷酸缓冲液,成分：磷酸二氢钠与磷酸氢二钠,如何证明色谱法获得的蛋白质是目的蛋白？,（三）电泳：,1.,概念：,带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。,2.,原理：,许多重要的生物大分子，如多肽、,核酸等都具有可解离的基团，在一定的,PH,下，这些基团会带上正电或负电。,在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。,电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离,。,3.,类型,:,琼脂糖,凝胶电泳、,聚丙稀酰胺,凝胶电泳。,影响蛋白质分子运动速度的因素,决定,运动方向,电场,作用力,形成,阻力,决定,运动速率,电荷性质,电荷量,分子形状,分子大小,聚丙烯酰胺凝胶电泳,1,、在测定蛋白质分子量时常用,十二烷基硫酸钠（,SDS,）,聚丙烯酰胺凝胶电泳。,聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂,N,N,-,亚甲基双丙烯酰胺在,引发剂,和,催化剂,的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。,N,N-,亚甲基双丙烯酰胺（形成交联）,丙烯酰胺和交联剂,N,N-,亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚反应,蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决,于它所带,净电荷的多少,以及,分子的大小,等因素。,2.,原理：,SDS,能使蛋白质发生完全变性,。由几条肽链组成的蛋白质复合体在,SDS,的作用下会,解聚成单条肽链,，因此,测定的结果只是,单条肽链的分子量,。,SDS,能与各种蛋白质形成,蛋白质,SDS,复合物,，,SDS,所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子,原有的电荷量,。因而掩盖了,不同种蛋白质间的电荷差别,，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。,3.SDS,作用机理,:,二、实验操作,样品处理粗分离,纯化,纯度鉴定,（一）蛋白质提取和分离步骤,血液,血浆,水 分,固体物质：,血浆蛋白、,无机盐、磷脂、葡萄糖等,血细,胞,白细胞,血小板,红细胞,（最多）,血红蛋白,（,90,）,两个,肽链,两个,一肽链,四个亚铁红素基团,血液有哪些成分？,用鸡的红细胞提取,DNA,，用猪、牛、羊的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？,鸡的红细胞具有细胞核，含有,DNA,，便于进行,DNA,的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。,血红蛋白,两个,肽链,两个,一肽链,四个亚铁,血,红素基团,每个肽链环绕一个,亚铁血红素基团，,此基团可携带,一分子氧或一分子二氧化碳，,血红蛋白因含有,血红素,而呈,红色。,血红蛋白的特点：,（,1,）洗 涤 红 细 胞,阅读思考：洗涤的,目的,是什么？洗涤的,方法,是什么？,洗涤干净,的标志是什么？,血液,100mL,3g,柠檬酸钠,低速离心,2 min,红细胞,血 浆,吸出血浆,红细胞,5,倍体积生理盐水,搅拌,10min,重复洗涤,3,次，,直至上清液没有黄色,其他血细胞,1.,样品处理和粗分离：,（二）操作过程,(1),红细胞的洗涤,:,洗涤目的,:,去除,杂蛋白,，以利于后续血红蛋白的,分离纯化，,洗涤次数,不可过少。,洗涤操作：,1,、采集血样。,2,、,低速短时间离心,3,、吸取血浆：上层,透明,的,黄色,血浆。,4,、盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为,0.9,的氯化钠溶液洗涤,(,生理盐水,),。,5,、低速离心（低速短时间）,6,、重复,4,、,5,步骤三次，直至上清液中已没有黄色，表明洗涤干净。,（速度越高和时间越长，会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀，达不到分离的效果）,（,2,）释放血红蛋白,阅读思考：,释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质？,为了加速释放过程，采取了什么措施？,目的分析：,蒸馏水,的作用是,_,。,加入,甲苯,的作用是,_,。,充分搅拌的目的是,_,。,使红细胞大量吸水胀裂,溶解红细胞的细胞膜,加速红细胞的破裂,为什么加入甲苯而不是其他的无机溶剂？,滤纸,过滤,脂类物质,（,3,）分离血红蛋白,分离过程,红细胞,混合液,高速离心,10min,离心管,烧杯,有机溶剂,血红蛋白,(3),分离血红蛋白溶液：,过程：,将搅拌好混合液转移到离心管内，以,2000r/min,的速度离心,10 min,。,试管中溶液层次：,第,1,层（最上层）：甲苯层（无色透明）；,第,2,层（中上层）：脂溶性物质,沉淀层,（白色）；,第,3,层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（红色,),；,第,4,层（最下层）：杂质,沉淀层,（暗红色）。,分离：,用滤纸,过滤,，除去脂溶性沉淀层，于,分液,漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。,(4),透 析：,过程：,取,1ml,的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有,300ml,的物质的量浓度为,20mmol/l,的,磷酸缓冲液,中（,pH,为,7.0,），透析,12,小时。,透析目的：,除去样品中分子量较小的杂质。,2.,凝胶色谱操作,:,（,1,）凝胶色谱柱的制作：,取长,40,厘米，内径,1.6,厘米的玻璃管，,两端需用砂纸磨平。,底塞的制作：,打孔挖出凹穴安装移液管头部覆盖尼龙网，再用,100,目尼龙纱包好，插到玻璃管的,一,端,。,注意事项,：,底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。,顶塞的制作：,打孔安装玻璃管,。组装：,将上述三者按相应位置组装成一个整体,。,安装其他附属结构。,（,2,）凝胶色谱柱的装填,凝胶的选择：,A,、,材料,：交联葡聚糖凝胶（,G-75,）。,B,、,代表意义,：,“,G,”,表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围,。,75,表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水,7.5,克。,凝胶的前处理：,配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于,蒸馏水,或,洗脱液,中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。,凝胶色谱柱的装填方法：,A,、固定：将色谱柱装置固定在支架上。,B,、装填：将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。,注意：,1,、凝胶装填时,尽量紧密,，以降低凝胶颗粒之间的空隙。,2,、装填凝胶柱时,不得有气泡,存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。,洗涤平衡：,装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在,50cm,高的操作压下，用,300ml,的,20mmol/l,的磷酸缓冲液（,pH,为,7.0,）充分,洗涤平衡,12,小时。,（,2,）凝胶色谱柱的装填,50cm,高,注意：,1,、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。,2,、,不能发生洗脱液流干,，露出凝胶颗粒的现象,。,（,3,）样品加入与洗脱,调节缓冲液面：,打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。,滴加透析样品：,吸管吸,1ml,样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，,吸管管口贴着管壁环绕移动加样,，同时注意,不要破坏凝胶面,。,（,3,）样品加入与洗脱,注意：,正确的加样操作是：,1,、不要触及并破坏凝胶面。,2,、贴壁加样。,3,、使吸管管口沿管壁环绕移动。,样品渗入凝胶床：,加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口,洗脱：,小心加入,pH=7.0,的,20mmol/l,的磷酸缓冲液到,适当高度,，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。,收集：,待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每,5ml,收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果,红色区带,均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）,思考下面的问题：,让血红蛋白处在,稳定的,pH,范围,内，维持结构和功能正常。,1,、在血红蛋白纯化的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？,2,、与其他蛋白质相比，血红蛋白有什么特点？这一特点对你进行血红蛋白的分离有什么启示？,血红蛋白是,有色,蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过,观察颜色,来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。,（三）,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳（选做）,鉴定血红蛋白纯度。,1.,目的：,1.,样品的,处理,通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液,2.,样品的,粗分离,经过透析去除分子量较小的杂质,3.,样品的,纯化,通过凝胶色谱法,将相对分子质量较大的杂质蛋白除去,4.,经,聚丙烯酰胺凝胶电泳,进行,纯度鉴定,。,小结：你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？,观察你处理的血液样品离心后,是否分层,（见教科书图,5-18,），,如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。,此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。,三、实验结果分析与评价,1,、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？,2,、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？,由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，,例如蓝色葡聚糖,2000,或红色葡聚糖，,观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。,如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。,如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；,如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。,3,、你能观察到蛋白质的分离过程中红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效果？,3.,凝胶色谱法,分离蛋白质,的,具体过程,用,SDS,测定蛋白质分子量的方法,使用,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳,测定蛋白质的分子量时，可选用一组,已知分子量的标准蛋白,同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的,电