12基因工程的基本操作程序(共85张PPT)

精讲精练系列,人教版选修三,1.2 基因工程的基本操作程序,基,因,因,工,工,程,程,培,培,育,育,抗,抗,虫,虫,棉,棉,的,的,简,简,要,要,过,过,程,程,：,：,提取,棉花细胞,(,含,抗虫基因,),苏云金芽孢杆菌,抗虫基因,与运载体,DNA,拼接,导入,普通棉花,(,无抗虫特性,),棉花植株,(,有,抗虫特性,),基,因,因,工,工,程,程,的,的,基,基,本,本,操,操,作,作,程,程,序,序,（1,）,）,目,目,的,的,基,基,因,因,的,的,获,获,取,取,（2,）,）,（3,）,）,将,将,目,目,的,的,基,基,因,因,导,导,入,入,受,受,体,体,细,细,胞,胞,（4,）,）,目,目,的,的,基,基,因,因,的,的,检,检,测,测,与,与,鉴,鉴,定,定,基,因,因表,达,达,载,载,体,体的,构,构,建,建,一,、,、,目,目,的,的,基,基,因,因,的,的,获,获,取,取,1,、,、,目,目,的,的,基,基,因,因,：,：,主,主,要,要,指,指,的,的,是,是,编,编,码,码,蛋,蛋,白,白,质,质,的,的结,构,构,基,基,因,因，,也,也,可,可,以,以,是,是,一,一,些,些,具,具,有,有,调,调,控,控,作,作,用,用,的,的,因,因,子,子,。,。,2,、,、,获,获,取,取,方,方,法,法,：,：,（1,）,）,从,从,基,因,因,文,文,库,库,中,获,获,取,取,目,目,的,的,基,基,因,因,；,；,（2,）,）,利,利,用,用PCR,技,技,术,术,扩,扩,增,增,目,目,的,的,基,基,因,因,；,；,（3,）,）,通,通,过,过DNA,合,合,成,成,仪,仪,用,用,化,化,学,学,方,方,法,法,直,直,接,接,合,合,成,成,（,一,一,）,）,从,从,基,基,因,因,文,文,库,库,中,中,获,获,取,取,目,目,的,的,基,基,因,因,1.,什,什,么,么,叫,叫,基,基,因,因,文,文,库,库,？,？,将,含,含,有,有,某,某,种,种,生,生,物,物,不,不,同,同,基,基,因,因,的,的,许,许,多,多DNA,片,片,断,断,，,，,导,导,入,入,到,到,受,受,体,体,菌,菌,的,的,群,群,体,体,中,中,，,，,各,各,个,个,受,受,体,体,菌,菌,分,分,别,别,含,含,有,有,这,这,种,种,生,生,物,物,的,的,不,不,同,同,基,基,因,因,，,，,称,称,为,为,基,基,因,因,文,文,库,库,。,。,基因文库,基因组文库,部分基因文库,（,cDNA,文库）,基因组,DNA,文库,cDNA,文库,基因组,DNA,文库与,cDNA,文库的,比,比较,补：原,核,核细胞,的,的基因,结,结构,非编码,区,区,非编码,区,区,编码区,编码区,上,上游,编码区,下,下游,与,RNA,聚合酶,结,结合位,点,点,启动子,终止子,RNA,聚合酶,能,能够识,别,别调控,序,序列中,的,的结合,位,位点，,并,并与其,结,结合。,转录开,始,始后，,RNA,聚合酶,沿,沿,DNA,分子移,动,动，并,以,以,DNA,分子的,一,一条链,为,为模板,合,合成,RNA,。,转录完,毕,毕后，,RNA,链释放,出,出来，,紧,紧接着,RNA,聚合酶,也,也从,DNA,模板链,上,上脱落,下,下来。,不能,转,转录为,信,信使,RNA,，不能,编码蛋,白,白质。,：能转,录,录相应,的,的信使,RNA,，能,编码蛋,白,白质,编码区,非编码,区,区,原核细,胞,胞的,基,基因结,构,构,有调,控,控遗传,信,信息表,达,达的核,苷酸序,列,列，在,该,该序列,中,中，,最重要,的,的是位,于,于编码,区,区上,游的,RNA,聚合酶,结,结合位,点,点。,非编码,区,区,非编码,区,区,编码区,编码区,上,上游,编码区,下,下游,启动子,终止子,补：真,核,核细胞,的,的基因,结,结构,编码区,非编码区,非编码区,与,RNA,聚合酶,结合位,点,点,内含子,外显子,能够编,码,码蛋白,质,质的序,列,列叫做,外,外显子,不能够,编,编码蛋,白,白质的,序,序列叫,做,做内含,子,子,启动子,终止子,编码区,上,上游,编码区,下,下游,内含子,：,：,外显子,：,：,真核,细,细胞,的,的,基,基,因,因结,构,构,编码,区,区,非编,码,码区,外显,子,子：,能,能编,码,码蛋,白,白质,的,的序,列,列,内含,子,子：,不,不能,编,编码,蛋,蛋白,质,质的,序,序列,：有,调,调控,作,作用,的,的核,苷,苷酸,序,序列,，,，,包括,位,位于,编,编码,区,区上,游,游的,RNA,聚合,酶,酶结,合,合位,点,点。,非编,码,码序,列,列：,包括,非,非编,码,码区,和,和内,含,含子,结构,基,基因,外显,子,子,内含,子,子,转录,、,、加,工,工修,饰,饰,mRNA,原核细胞,真核细胞,不同点,编码区是,_的,编码区是间隔的、_的,相同点,都由能够编码蛋白质的,_ _,和具有调控作用的_,区组成的,原核,细,细胞,与,与真,核,核细,胞,胞的,基,基因,结,结构,比,比较,思考,编码,相,相同,数,数目,氨,氨基,酸,酸的,蛋,蛋白,质,质，,原,原核,细,细胞,与,与真,核,核细,胞,胞基,因,因结,构,构一,样,样长,吗,吗？,连续,不连,续,续,编码,区,区,非编,码,码,基因,表,表达,的,的计,算,算,在真,核,核生,物,物中,，,，对,应,应的,是,是的碱,基,基数,DNA,mRNA,蛋白质,转录,翻译,631,氨基,酸,酸数,碱基,数,数,？,补充,资,资料,基因,中,中外,显,显子,基因,组,组文,库,库与,部,部分,基,基因,文,文库,的,的关,系,系,基因,组,组文,库,库和,部,部分,基,基因,文,文库,的,的比,较,较,文库类型,cDNA文库,基因组文库,文库大小,基因中启动子,基因中内含子,基因多少,物种间基因交流,小,大,无,有,无,有,某种,生,生物,的,的部,分,分基,因,因,某种,生,生物,的,的全,部,部基,因,因,可以,部分,基,基因,可,可以,概念,辨,辨析,基因,文,文库,与,与基,因,因库,基因,库,库是,指,指某,一,一生,物,物群,体,体中,的,的全,部,部基,因,因。,基因,文,文库,与,与基,因,因克,隆,隆,基因,克,克隆,是,是只,包,包含,某,某些,特,特定,基,基因,或,或,DNA,片段,的,的克,隆,隆。,基因,文,文库,中,中包,含,含着,为,为数,众,众多,的,的克,隆,隆，,建,建成,后,后可,供,供随,时,时选,取,取其,中,中任,何,何一,个,个基,因,因克,隆,隆之,用,用。,基因,组,组文,库,库的,构,构建,模,模式,图,图,通过,对,对,受体,菌,菌,的培,养,养而,储,储存,基,基因,2.,基因,文,文库,的,的构,建,建方,法,法,（,1,）鸟枪,法,法,（,2,）反转,录,录法,（,3,）根据,已,已知,的,的氨,基,基酸,序,序列,合,合成,DNA,法,人工,合,合成,法,法,（真核,生,生物）,多用,于,于原,核,核生,物,物,直接,分,分离,法,法,（,1,）鸟,枪,枪法,：,：,供体,细,细胞,中,中的,DNA,许多,DNA,片段,运载,体,体,限制,酶,酶,与载,体,体连,接,接,受体,细,细胞,产生,特,特定,性,性状,导入,外源,DNA,扩增,目的基因,分离,(,直接分离法,),（2）反转录法（cDNA,文,文库的构建,方,方法,）,以目的基因,转,转录成的信使RNA为模板，再反转录酶的催化下反,转,转录成互补,的,的单链DNA，然后在DNA聚合,酶,酶的作用下,合,合成双链DNA，即cDNA，从而获得,所,所需的基因,。,。,（,3,）根据已知,的,的氨基酸序,列,列合成,DNA,法 ：,根据已知蛋,白,白质的氨基,酸,酸序列，推,测,测出相应的,信,信使,RNA,序列，然后,按,按照碱基互,补,补配对原则,，,，推测出它,的,的结构基因,的,的核苷酸序,列,列，再通过,化,化学方法，,以,以单核苷酸,为,为原料合成,目,目的基因。,蛋白质的氨,基,基酸序列,mRNA,的核苷酸序,列,列,结构基因的,核,核苷酸序列,推测,推测,目的基因,化学合成,上述三种目,的,的基因提取,的,的方法有何,优,优缺点？,优点,缺点,鸟枪法,反转录法,根据已知氨基酸合成DNA法,操作简便广,泛,泛使用,工作量大，,盲,盲目，分离,出,出来的有时,并,并非一个基,因,因,专一性强,操作过程麻,烦,烦，,mRNA,很不稳定，,要,要求的技术,条,条件较高,专一性最强,仅限于合成,核,核苷酸对较,少,少的简单基,因,因,思考：,如何从基因,文,文库中得到,所,所需要的基,因,因？,依据：目的,基,基因的有关,信,信息。,如：根据基,因,因的核苷酸,序,序列；,基因的功能,；,；,基因在染色,体,体上的位置,；,；,基因的转录,产,产物,mRNA,；,基因翻译产,物,物蛋白质等,特,特性。,注意：,基因文库中不是直接,保,保管相应基,因,因，而是保存受体菌，菌中含基,因,因。,（二）利用,PCR,技术扩增目,的,的基因,1,2,3,4,5,22,55,72,94,时间（,min,）,温度,（）,PCR,反应,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,适温延伸,3,高温变性,1,低温退火,2,重复,13,步,2530,轮,目的,DNA,片段,扩增,100,万倍以上,DNA,双螺旋,DNA,单链,与引物复性,DNA,变性,形成,2,条单链,子链延伸,DNA,加倍,模板,DNA,95,PCR的基,本,本原理,PCR反应,条,条件,PCR过程,PCR的特,点,点,50,引物,1,引物,2,DNA,引物,PCR的基,本,本原理,PCR反应,条,条件,PCR过程,PCR的特,点,点,引物,1,引物,2,DNA,引物,72,Taq,酶,Taq,酶,PCR的基,本,本原理,PCR反应,条,条件,PCR过程,PCR的特,点,点,72,第,1,轮结束,第,2,轮开始,PCR的基,本,本原理,PCR反应,条,条件,PCR过程,PCR的特,点,点,95,50,72,Taq,Taq,Taq,Taq,PCR的基,本,本原理,PCR反应,条,条件,PCR过程,PCR的特,点,点,72,第,2,轮结束, 概念：,PCR,全称为,_,，是一项,在生物,_,复制,_,的核酸合成,技,技术。,前提条件,：,：,_,；,原料：,_,、,_,、,_,、,_,。,原理：,_,方式：以,_,方式扩增，即,_,（,n,为扩增循,环的次数）,结果：,聚合酶链式反,应,应,体外,特定,DNA,片段,DNA,复制,已知基因的核,苷,苷酸序列,四种脱氧核苷,酸,酸,DNA,引物,热稳定,DNA,聚合酶,指数,2,n,使目的基因的,片,片段在短时间,内,内成百万倍地,扩,扩增,模板,DNA,过程：,变性、退火、,延,延伸三步曲,变性：加热至,90,95,双链,DNA,解链成为单链,DNA,退火：冷却至,55,60,部分引物与模,板,板的单链,DNA,的特定互补部,位,位相配对和结,合,合,延伸：加热至,70,变性,退火,延伸,过程：,a,、,DNA,变性（,90-95,）：双链,DNA,模板,在热作用下，,_,断裂，形成,_,b,、退火（复性,55-65,）：系统温度,降,降低，引,物,物与,DNA,模板结合，形,成,成局部,_,。,c,、延伸（,70-75,）：在,Taq,酶的作用下，,从,从,引物的,5,端,3,端延伸，合成,与,与模板互补,的,_,。,氢键,单链,DNA,双链,DNA,链,思考？,1,个,DNA,分子进行,PCR,扩增,循环,4,次，,理论上至少需,要,要几个引物？,2,（,2,n,-1,）,(n,为循环次数,),（,2,4,-1,）,2=30,模板,DNA,特异性引物,耐热,DNA,聚合酶,dNTPs,Mg,2+,PCR,体系基本组成,成,成分,一对寡核苷酸,序,序列：与目的,基,基因的起始段,互,互补,PCR,总结：,PCR,的基本反应步,骤,骤,变性,90-95,C,延伸,70-75C,退火,55-60C,PCR,总结：,TaqDNA,聚合酶（,thermus aquaticus),酶活性,(%),温度,(),40 50 6070 80 90100,100,80,60,40,20,PCR,技术扩增与,DNA,复制的比较,PCR技术,DNA复制,相同点,原理,原料,条件,不同点,解旋方式,场所,酶,结果,碱基互补配对,四种脱氧核苷,酸,酸,模板、能量、,酶,酶,DNA,在高温下变性,解,解旋,解旋酶催化,体外复制,细胞核内,热稳定的,DNA,聚合酶,细胞内的,DNA,聚合酶,大量的,DNA,片段,形成整个,DNA,分子,PCR的基本,原,原理,PCR反应条,件,件,PCR过程,PCR的特点,重复,30,轮后,2,30,=1,073,741,824,模板,DNA,第,1,轮扩增,第,2,轮扩增,第,3,轮扩增,第,4,轮扩增,第,5,轮扩增,第,6,轮扩增,理想拷贝数,=2,n,n,循环次数,实际拷贝数,=(1+x),n,X,平均效率,约为,0.85,n,循环次数,根据已知蛋白,质,质的氨基酸序,列,列，推测出相,应,应的,mRNA,序列，然后按,照,照碱基互补配,对,对原则，推测,出,出它的结构基,因,因的核苷酸序,列,列，再通过化,学,学方法，以单核苷酸为,原,原料合成目的,基,基因。,蛋白质的氨基,酸,酸序列,mRNA,的核苷酸序列,结构基因的核,苷,苷酸序列,推测,目的基因,化学合成,（三）化学方,法,法人工合成目,的,的基因,人工合成,(,基因比较小,),DNA,合成仪,从基因文库中,获,获取,利用PCR技,术,术扩增,利用化学方法,人,人工合成,归纳：获取目,的,的基因的方法,用一定的,_,切割,质粒，使其出,现,现一个切,口，露出,_,。,用,_,切断目,的基因，使其,产,产生,_,_,。,将切下的目的,基,基因片段插入,质,质粒的,_,处，,再加入适量,_,，形成了一个,重,重组,DNA,分子（重组质,粒,粒）,限制酶,黏性末端,同一种限制酶,相同的黏性末,端,端,切口,DNA,连接酶,1.,过程,:,二、构建表达载体,核心,质粒,DNA,分子,限制酶处理,一个切口,两个黏性末端,两个切口,获得目的基因,DNA,连接酶,重组,DNA,分子（重组质,粒,粒）,同一种,过程,:,2.,基因表达载体,的,的目的,（,1,）使目的基因,在,在受体细胞中,稳,稳定存在并可,以,以遗传给下一,代,代；,（,2,）使目的基因,能,能够表达和发,挥,挥作用。,科学家在培育,抗,抗虫棉时，经,历,历了多次失败,，,，才获得成功,。,。,起初把苏云金,芽,芽孢杆菌的,抗虫基因插入载体质粒,中,中，然后导入,棉,棉花的受精卵,中,中，结果抗虫,基,基因在棉花体,内,内没有表达。,然后在插入抗,虫,虫基因的质粒,中,中插入启动子,(,抗虫基因首端,),，导入棉花受,精,精卵，长成的,棉,棉花植株还是,没,没有抗虫能力,。,。科学家又在,有,有启动子、抗,虫,虫基因的质粒,中,中插入,终止子,(,抗,虫,虫,基,基,资,料,料,:,思,考,考,：,：作,为,为,基,基,因,因,工,工,程,程,表,表,达,达,载,载,体,体,，,，,只,只,需,需,含,含,有,有,目,目,的,的,基,基,因,因,就,就,可,可,以,以,完,完,成,成,任,任,务,务,吗,吗,？,？,为,为,什,什,么,么,？,？,（,（,P,15,）,不,可,可,以,以,。,。,因,为,为,目,目,的,的,基,基,因,因,在,在,表,表,达,达,载,载,体,体,中,中,得,得,到,到,表,表,达,达,并,并,发,发,必须构建上述元件的,主要理由,是：,（,1,）,生,生,物,物,之,之,间,间,进,进,行,行,基,基,因,因,交,交,（,2,）,通,通,过,过,cDNA,文,库,库,获,获,得,得,的,的,目,目,的,的,基,基,因,因,没,没,有,有,启,启,动,动,子,子,，,，,只,只,将,将,编,编,码,码,序,序,列,列,导,导,入,入,受,受,体,体,生,生,物,物,中,中,无,无,法,法,转,转,录,录,；,；,（,3,）,目,目,的,的,基,基,因,因,是,是,否,否,导,（,4,）,为,为,了,了,增,增,强,强,目,目,的,的,基,基,因,因,的,的,表,表,达,达,水,水,平,平,（,5,）,有,有,时,时,需,需,要,要,确,3.,基,因,因,表,表,达,达,载,载,体,体,的,的,组,组,成,成,：,：,它们有,什,什么作,用,用？,a,、目的,基,基因,b,、启动,子,子,c,、终止,子,子,d,、标记,基,基因,调节基,因,因,操纵基,因,因,结构基,因,因,RNA,聚合酶,半乳糖,苷,苷酶,酶,酶,RNA,聚合酶,启动子,RNA,聚合酶,启动子,：位于基,因,因首端,的,的一段,特,特殊的,DNA,片断，,它,它是,RNA,聚合酶,识,识别和,结,结合的,部,部位，,有,有了它,才,才能驱,动,动基因,转,转录出,mRNA,，最终,获,获得蛋,白,白质。,思考1,：,：表达载,体,体为什,么,么一定,要,要有启,动,动子？,（1）,生,生物之,间,间进行,基,基因交,流,流，只,有,有使用,受,受体生,物,物自身,基,基因的,启,启动子,才,才能有,利,利于基,因,因的表,达,达；,（2）,通,通过cDNA,文,文库获,得,得的目,的,的基因,没,没有启,动,动子，,只,只将编,码,码序列,导,导入受,体,体细胞,无,无法转,录,录。,思考2,：,：终止子,的,的作用,是,是什么,？,？,终止子,是,是位于,基,基因尾,端,端的一,段,段特殊,的,的DNA片断,，,，能终,止,止mRNA的,转,转录。,是为了,鉴,鉴别受,体,体细胞,中,中是否,含,含有目,的,的基因,，,，从而,将,将有目,的,的基因,的,的细胞,筛,筛选出,来,来。,思考,3,：标记基,因,因有什,么,么作用,？,？,载体与表达载,体,体的区别,：,：二者,都,都有标,记,记基因,和,和复制,原,原点两,部,部分,DNA,片段。,表,表达载,体,体在载,体,体基础,上,上增加,了,了目的,基,基因、,启,启动子,、,、终止,子,子三部,分,分结构,。,。,注意,用到的,工,工具酶,：,：既用到,限,限制酶,切,切割载,体,体，又,用,用到,DNA,连接酶,将,将目的,基,基因和,载,载体拼,接,接，两,种,种酶作,用,用的化,学,学键都,是,是磷酸,二,二酯键,。,。,启动子,、,、终止,子,子对于目,的,的基因,表,表达必,不,不可少,。,。,目的基,因,因不能,单,单独进,入,入受体,细,细胞，必需以,表,表达载,体,体的方,式,式携带,进,进去。,基因工,程,程技术,路,路线,三、将,目,目的基,因,因导入,受,受体细,胞,胞,常用的,受,受体细,胞,胞：,有大肠,杆,杆菌、,枯,枯草杆,菌,菌、土,壤,壤农杆,菌,菌、酵,母,母菌和,动,动植物,细,细胞等,。,。,将目的,基,基因导,入,入受体,细,细胞的,原,借鉴细菌或,病,病毒侵,染,染细胞的途径,。,。,（一）,转,转化：,目的基,因,因进入,_,内，并,且,且在,受,受体,细,细胞内,维,维持,_,和,_,的过程,受体细,胞,胞,稳定,表达,（二）,方,方法,将目的,基,基因导,入,入,植物细,胞,胞,将目的,基,基因导,入,入,动物细,胞,胞,将目的,基,基因导,入,入,微生物,细,细胞,农杆菌,转,转化法,基因枪,法,法,花粉管,通,通道法,显微注,射,射法,感受态,细,细胞,1.将,目,目的基,因,因导入,植,植物细,胞,胞,农杆菌,转,转化法,基因枪,法,法,花粉管,通,通道法,（,1,）农杆,菌,菌转化,法,法,特点,：,：,易感染,双,双子叶,植,植物和,裸,裸子植,物,物，对,大,大多数,单,单子叶,植,植物没,有,有感染,能,能力,原理,：,：,Ti,质粒上,的,的,T-DNA,可以转,移,移到受,体,体细胞,，,转化,过,过程,:,Ti,质粒,目的基,因,因,构建,表达载,体,体,导入,植物细,胞,胞,插入,植物细,胞,胞染色,DNA,表达,新性状,转入,农杆菌,基因枪,法,法又称,微,微弹轰,击,击法，,是,是利用压,缩,缩气体,产,产生的,动,动力，将包,裹,裹在金,属,属颗粒,表,表面的,表,表达载,体,体,DNA,打入受,体,体细胞,中,中，使目,的,的基因,与,与其整,合,合并表,达,达的方,法,法。,（,2,）基因,枪,枪法,适用于,单子叶,植,植物,（,3,）花粉,通,通道法,植物花,粉,粉在柱,头,头上萌,发,发后，,花,花粉管,要,要穿过,花,花柱直,通,通胚囊,。,。花粉,管,管通道,法,法就是,在,在植物,受,受粉后,，,，花粉,形,形成的,花,花粉管,还,还未愈,合,合前，,剪,剪去柱,头,头，然,后,后，滴,加,加,DNA,（含目的基,因,因），使目,的,的基因借助,花,花粉管通道,进,进入受体细,胞,胞。,适用于被子植物,胚珠,花药,花丝,柱头,花柱,子房壁,子房,雄蕊,雌蕊,2.将目的,基,基因导入动,物,物细胞,（1）方法,：,：显微注射,法,法（将基因表,达,达载体提纯,，,，用显微仪,注,注射到受精卵中）,思考：为什,么,么要用受精,卵,卵而不用体,细,细胞？,（,2,）操作程序,:,提纯含目的,基,基因表达载,体,体,取受精卵,显微注射,移植到子宫,受精卵发育,新性状动物,常用法：,Ca,2+,处理,常用菌：大肠杆菌,微生物作受,体,体细胞原因,：,：,繁殖快、多,为,为单细胞、,遗,遗传物质相,对,对少,过程：,Ca,2+,处理大肠杆,菌,菌,感受态细胞,表达载体与,感,感受态细胞,混,混合,感受态细胞,吸,吸收,DNA,3.将目的,基,基因导入微,生,生物细胞,思考：为什,么,么要用,Ca,2+,处理受体细,胞,胞？,用,Ca,2,处理，增加,细,细菌细胞壁,的,的通透性,受体生物,植物,动物,微生物,受体细胞,导入方法,受精卵,体细胞,受精卵,细胞,/,个体,农杆菌转化,法,法,基因枪法,花粉管通道,法,法,显微注,射技术,用,Ca,2+,处理成感受,态,态细胞,采用基因工,程,程的方法培,育,育抗虫棉，,下,下列导入目,的,的基因的作,法,法正确的是,（,（）,A.,将毒素蛋白,注,注射到受精,卵,卵中,B.,将编码毒素,蛋,蛋白的,DNA,序列，与质,粒,粒重组，导,入,入细菌，用,该,该细菌感染,棉,棉的体细胞,，,，再进行组,织,织培养,C.,将编码毒素,蛋,蛋白的,DNA,序列，与质,粒,粒重组，注,射,射到棉的子,房,房并进入受,精,精卵,D.,将编码毒素,蛋,蛋白的,DNA,序列，注射,到,到棉受精卵,中,中,BC,四、目的基,因,因的检测与,鉴,鉴定,检测:,是否插入目,的,的基因,是否转录,是否翻译,鉴定:,分子水平鉴,定,定,个体生物学,水,水平鉴定,1,、检测转基,因,因生物染色,体,体的,DNA,上是否插入,了,了目的基因, 首先取,出,出转基因生,物,物的基因组,DNA,；,（,1,）方法,:,DNA,分子杂交,（,2,）过程,:,将含目的基,因,因的,DNA,片段用放射,性,性同位素等,作,作标记,以此做探针；,使探针和转,基,基因生物的,基,基因组杂交,若显示出杂,交,交带,表明染色体,已,已插入染色,体,体,DNA,中。,（一）检测,基因探针,：,是一段带有,检,检测标记，,且,且序列已知,的,的，与目的,基,基因互补的,核,核酸序列。,基因探针,通,通过分子,杂,杂交与目,的,的基因结,合,合，产生,杂,杂交信号,，,，能从浩,翰,翰的基因,组,组中把目,的,的基因显,示,示出来。,DNA,分子杂交,示,示意图,采用一定,的,的技术手,段,段，将两,种,种生物的,DNA,分子的单,链,链放在一,起,起，如果,这,这两个单,链,链具有互,补,补的碱基,序,序列，那,么,么，互补,的,的碱基序,列,列就会结,合,合在一起,，,，形成杂,合,合双链区,；,；在没有,互,互补碱基,序,序列的部,位,位，仍然,是,是两条游,离,离的单链,。,。,（二）鉴,定,定（个体,生,生物学水,平,平）,2,、检测目,的,的基因是,否,否转录出,了,了,mRNA,3,、检测目,的,的基因是,否,否翻译成,蛋,蛋白质,抗虫鉴定,、,、抗病鉴,定,定、活性,鉴,鉴定等,方法,:,分 子,杂,杂 交,方法,:,抗原,-,抗体杂交,过程,:,用上述探,针,针和转基,因,因生物的,mRNA,杂交,若出现杂,交,交带,表明目的,基,基因转录,出,出了,mRNA,。,提取,（,3,）检测目,的,的基因是,否,否翻译成,蛋,蛋白质,方法,抗,抗原,-,抗体杂交,苏云金杆菌,Bt,毒素蛋白,将,Bt,毒蛋白注,射,射小鼠体,内,内,从小鼠血,管,管抽出血,液,液分离出,抗,抗,Bt,毒素的抗,体,体,抗体,蛋白质,出现杂交,带,带,脱分化,组织培养,若不能表,达,达，要对,抗,抗虫基因,再,再进行修饰。,怎样检验,抗,抗虫基因,在,在棉细胞,内,内是否表,达,达呢？,没有抗虫,基,基因,的棉植株,有抗虫基,因,因的棉植,株,株,棉铃虫,虫没有死,虫被杀死,没有表达,目的基因,表,表达,类型,步骤,检测内容,方法,结果显示,分子检测,第一步,目的基因是否进入受体细胞,DNA,分子杂交,（,DNA,和,DNA,之间）,是否成功显示出杂交带,第二步,目的基因是否转录出,mRNA,分子杂交技术,（,DNA,和,mRNA,之间）,是否成功显示出杂交带,第三步,目的基因是否翻译出蛋白质,抗原,抗体杂交,是否成功显示出杂交带,个体水平鉴定,包括抗虫、抗病的,接种实验,，以确定是否有抗性以及抗性的程度；,基因工程产品与天然产品的活性比较，以确定功能是否相同等。,目的基因,的,的表达和,检,检测,提示：,DNA,分子杂交,技,技术首先,提,提取受体,细,细胞中的,DNA,，然后高,温,温解成单,链,链，再与,同,同位素标,记,记的,DNA,探针杂交,；,；,抗原,抗,抗体杂交,所,所用到的,抗,抗体是用,表,表达出的,蛋,蛋白质注,射,射动物进,行,行免疫，,产,产生相应,的,的抗体，,并,并提取出,而,而来的。,归纳:基因工程,的,的基本操,作,作程序,获取目的,基,基因,从基因文,库,库,利用PCR,化学方法,人,人工合成,构建基因,表,表达载体,目的基因,、,、启动子,、,、终止子,、,、标记基,因,因,将目的基,因,因导入受,体,体细胞,转化法（,微,微生物）,、,、农杆菌,转,转化法（,植,植物）、,显,显微注射,法,法（动物,）,）,目的基因,的,的检测与,鉴,鉴定,检测：是,否,否插入、,转,转录、翻,译,译,为什么要,构,构建基因,文,文库？直,接,接从含有,目,目的基因,的,的生物体,内,内提取不,行,行吗？,构建基因,文,文库是获,取,取目的基,因,因的方法,之,之一，并,不,不是唯一,的,的方式。,如,如果所需,要,要的目的,基,基因序列,已,已知，就,可,可以通过,PCR,方式从含,有,有该基因,的,的生物的,DNA,中，直接,获,获得，也,可,可以通过,反,反转录，,用,用,PCR,方式从,mRNA,中获得，,不,不一定要,构,构建基因,文,文库。,但如果所,需,需要的目,的,的基因的,序,序列完全,不,不知，或,只,只知道目,的,的基因序,列,列的一段,，,，或想从,一,一种生物,体,体内获得,许,许多基因,，,，或者想,知,知道这种,生,生物与另,一,一种生物,之,之间有多,少,少基因不,同,同，或者,想,想知道一,种,种生物在,个,个体发育,的,的不同阶,段,段表达的,基,基因有什,么,么不同，,或,或者想得,到,到一种生,物,物的全基,因,因组序列,，,，往往就,需,需要构建,基,基因文库,。,。,利用大肠,杆,杆菌可以,生,生产出人,的,的胰岛素,，,，联系前,面,面有关细,胞,胞器功能,的,的知识，,结,结合基因,工,工程操作,程,程序的基,本,本思路，,思,思考一下,，,，若要生,产,产人的糖,蛋,蛋白，可,以,以用大肠,杆,杆菌吗？,有些蛋白质肽链,上,上有共价结合的,糖,糖链，这些糖链,是,是在内质网和高,尔,尔基复合体上加,工,工完成的，内质,网,网和高尔基复合,体,体存在于真核细,胞,胞中，大肠杆菌,不,不存在这两种细,胞,胞器，因此，在,大,大肠杆菌中生产,这,这种糖蛋白是不,可,可能的。,寻根问底：,根据农杆菌可将,目,目的基因导入双,子,子叶植物的机理,你能分析出农杆,菌,菌不能将目的基,因,因不能导入单子,叶,叶植物的原因吗,?,若将一个抗病基,因,因导入小麦中,理论上讲你应该,怎,怎样做,?,要选择合适的,农,农杆菌菌株，因,为,为不是所有的农,杆,杆菌菌株都可以,侵,侵染单子叶植物,；,；,要加趋化和诱,导,导的物质，目的,是,是使农杆菌向植,物,物组织的受伤部,位,位靠拢（趋化性,）,）和激活农杆菌,的,的诱导的基因，,使,使,T-DNA,转移并插入到染,色,色体,DNA,上。,酚类诱导物主要,在,在双子叶植物细,胞,胞壁中合成，通,常,常不存在于单子,叶,叶植物中,4.-,珠蛋白是动物血,红,红蛋白的重要组,成,成成分。当它的,成,成分异常时，动,物,物有可能患某种,疾,疾病，如镰刀形,细,细胞贫血症。假,如,如让你用基因工,程,程的方法，使大,肠,肠杆菌生产出鼠,的,的,-,珠蛋白，想一想,，,，应如何进行设,计,计？,（,1,）从小鼠中克隆,出,出,-,珠蛋白基因的编,码,码序列（,cDNA),。,（,2,）将,cDNA,前接上在大肠杆,菌,菌中可以适用的,启,启动子，另外加,上,上抗四环素的基,因,因，构建成一个,表,表达载体。,（,3,）将表达载体导,入,入无四环素抗性,的,的大肠杆菌中，,然,然后在含有四环,素,素的培养基上培,养,养大肠杆菌。如,果,果表达载体未进,入,入大肠杆菌中，,大,大肠杆菌会不含,有,有抗四环素基因,而,而死掉；如果培,养,养基上长出大肠,杆,杆菌菌落，则表,明,明,-,珠蛋白基因已进,入,入其中。,（,4,）培养进入了,-,珠蛋白基因的大,肠,肠杆菌，收集菌,体,体，破碎后从中,提,提取,-,珠蛋白。,演讲完毕，谢谢,观,观看！,