实验二+蛋白质及氨基酸的显色反应

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验二、蛋白质及氨基酸的显色反应,Department of life science,实验二、蛋白质及氨基酸的显色反应,目的和要求,1.,学习和了解常用的几种鉴定蛋白质与氨基酸的方法。,2.,进一步认识氨基酸是蛋白质的基本组成单位。,、双缩脲反应,(,Biurea,reaction),原理,:,双缩脲反应,:,在,碱性,条件下，双缩脲与二价铜离子作用，生成紫红色配合物的反应。当加热至,180,左右时，两分子尿素缩合脱去一分子氨，生成双缩脲。在肽和蛋白质分子中具有肽键，其结构与双缩脲类似，也能发生此反应，生成蓝紫色或紫红色的配合物。该反应常用于蛋白质的定性或定量测定。此反应所产生颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关。,紫红色铜双缩脲复合物分子结构为：,操作步骤,一、取少量尿素结晶，放入干燥试管中，用微火加热使尿素熔化。熔化的尿素开始硬化时，停止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。冷却后，加,10%NaOH,溶液约,1mL,，振荡混匀，再加入,1%CuSO,溶液,1,滴，振荡之。观察出现的粉红颜色。（,避免添加过量硫酸铜，生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色,）。,二、取另一支试管，加,1mL,蛋白质溶液和,10%,氢氧化钠溶液,2mL,，摇匀，再加,1%,硫酸铜溶液两滴，随加随摇，观察紫玫瑰色的出现。,、茚三酮反应,(,Ninhydrin,reaction),原理,:,除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应生成黄色物质外，所有的,-,氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。该反应分两步进行，首先是氨基酸被氧化，产生,CO,、,NH,3,和醛，而水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所生成之还原型茚三酮与另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有色物质。,、茚三酮反应,(,Ninhydrin,reaction),此反应的适宜,pH,为,5-7,，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同,pH,条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。该反应十分灵敏，,1,：,1 500 000,浓度的氨基酸水溶液即能显示反应，因此是一种常用的氨基酸定量方法。,操作步骤,一、取,2,支试管分别加入蛋白质溶液和,0.5%,甘氨酸溶液,1mL,，再加,0.5mL 0.1%,茚三酮水溶液混匀，在沸水浴中加热,12min,，观察颜色由粉色变成紫红色再变蓝。,二、在一小片滤纸上滴上一滴,0.5%,的甘氨酸溶液，风干后，再在原处滴,0.1%,的茚三酮乙醇溶液一滴，在微火旁烘干显色，观察紫红色斑点的出现。,、黄色反应,(,Xanthoproteic,reaction),原理,凡是含有苯环的化合物都能与浓硝酸作用产生黄色的硝基苯衍生物。该化合物在碱性溶液中进一步转化成深橙色的硝醌酸钠。,在蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基易发生上述反应，而苯丙氨酸不易硝化，需加少量浓硫酸催化才能呈明显的正反应。皮肤、指甲、头发等遇浓硝酸变黄即为这一反应的结果。,操作步骤,:,一、取一支试管加,4,滴,0.5%,苯酚溶液，再加浓硝酸,2,滴，观察黄色出现，冷却后逐滴加入,10%,氢氧化钠溶液，观察颜色转变为橙。,二、取一支试管加蛋白质溶液,4,滴及浓硝酸,2,滴，由于强酸的作用，开始蛋白质形成白色沉淀，小火加热，则沉淀变为黄色，冷却之，逐滴加入,10%,氢氧化钠溶液，颜色由黄色转变成深橙黄色。,三、剪少许指甲或头发放入试管中，加入数滴浓硝酸，观察颜色变化。,管号,1,2,3,4,材料,0.5,苯酚,鸡蛋清液,指甲,头发,量（滴,),4,4,少许,少许,浓硝酸（滴）,4,2,20,20,现象,加入,NaOH,后现象变化,黄色反应,、坂口反应,(,Sakaguchi,reaction),原理,在次溴酸钠或次氯酸钠存在的条件下，许多含有胍基的化合物,(,如胍乙酸、甲胍、胍基丁胺等,),能与,-,萘酚发生反应生成红色物质。在,20,种氨基酸中唯有精氨酸含有胍基，所以只有它呈正反应。,、坂口反应,(,Sakaguchi,reaction),生成的氨被次溴酸钠或次氯酸钠氧化生成氮。该反应中过量的次溴酸钠或次氯酸钠是不利的，因其能进一步缓慢氧化，使产物破裂分解，引起颜色消失。但加入适量尿素可破坏过量的次溴酸钠。酪氨酸、色氨酸和组氨酸也能降低产生颜色的强度。甚至会阻止颜色的生成。,该反应灵敏度达,1,：,250 000,。因此常用于定量测定精氨酸的含量和定性鉴定含有精氨酸的蛋白质。,操作步骤,取,2,支试管，分别加入,1mL 0.3%,精氨酸溶液和蛋白溶液，各加,20%,氢氧化钠溶液,5,滴，,1%-,萘酚酒精溶液,2,滴，次氯酸钠溶液,6,滴，摇匀，放置片刻，观察出现的颜色。,试剂,（滴）,管号,H,2,O,0.3,精氨酸,蛋白质溶液,20,NaOH,萘酚,NaClO,现象记录,0,0,5,5,3,6,0,5,0,5,3,6,5,0,0,5,3,6,坂口反应,、乙醛酸反应,(,Adamkiewica,-Hopkins-Cole reaction),原理,在浓硫酸存在下，色氨酸与乙醛酸反应生成紫色物质，色氨酸在浓硫酸中与一些醛类反应也形成有色物质。很多人用含有少量醛杂质的冰醋酸或芳香醛等进行此反应。硝酸根、亚硝酸根、氯酸根及过多的氯离子均能妨碍此反应，有微量硫酸铜或,Fe,离子存在时，可以加强色氨酸的阳性反应。,操作步骤,向试管中加数滴蛋白质溶液，再加冰醋酸,(,常含有少量乙醛酸或醛类,),约,1mL,并混匀倾斜试管，谨慎地沿着管壁加浓硫酸,(AR),约,1mL,，使其重迭，且勿摇匀。静置后，观察在两液界面上出现的红紫色环，于水浴中微热，可加快色环形成。,试剂,（滴）,管号,白明胶,0.3,色氨酸（滴）,蛋白质溶液（滴）,冰醋酸（,ml,）,浓硫酸（,ml,）,现象记录,1,5,1,1,2,5,1,1,3,5,1,1,乙醛酸反应,、偶氮反应,(,Azo,reaction),原理,偶氮化合物,(Ehrlich,氏偶氮试剂,),与酚核或咪唑环结合产生有色物质。它与酪氨酸和组氨酸反应的产物分别为红色和樱桃红色,.,含有酪氨酸和组氨酸的蛋白质也有此反应。,操作步骤,取,2,支试管，分别加入,0.3%,组氨酸溶液和纯鸡蛋清各,4,滴，再各加入新配制的重氮试剂,8,滴摇匀，加入,2,滴,20%,氢氧化钠溶液，再摇匀。过几分钟，观察颜色的形成，一般出现樱桃红色。,试剂,（滴）,管号,0.3,组氨酸（滴）,鸡蛋清（滴）,偶氮试剂,20,NaOH,溶液,现象记录,1,4,8,2,2,4,8,2,偶氮反应,反应名称,反应基团,反应产物及现象,用途,1,、双缩脲反应,肽键,Cu,Cu,双缩脲络合物（兰紫色）,测蛋白质含量鉴定蛋白质水解 是否完全,2,、茚三酮反应,-,氨基酸,兰紫色,测,AA,含量检验,AA,及蛋白质,3,、黄色反应,苯环、,Trp,、,Tyr,黄色硝醌酸生成,鉴定,Trp,、,Tyr,4,、坂口反应,胍基,玫瑰红色产物生成,鉴定,Arg,测定,Arg,含量,5,、乙醛酸反应,吲哚环,中间生成兰紫色环,鉴定,Trp,6,、偶氮反应,酚核、咪唑基,有橙色和鲜红色产物生成,鉴定,His,、,Tyr,试剂和器材,一、试剂,1.,蛋白质溶液：取,5mL,蛋清，用蒸馏水稀释至,100mL,，搅拌均匀后，用纱布过滤。,2.0.1%,茚三酮乙醇溶液：称取,0.1g,茚三酮，溶于,100mL95%,乙醇。临用前配制。,3.,尿素粉末,4.1%,硫酸铜溶液,5.10%,氢氧化钠溶液和,20%,氢氧化钠溶液,6.0.5%,苯酚溶液,7.,浓硝酸和浓硫酸,(A.R.),8.0.1%,茚三酮水溶液,9.0.3%,精氨酸、,0.3%,组氨酸、,0.5%,甘氨酸,10.,纯鸡蛋清,11.1%-,萘酚乙醇溶液，临用时配制,12.,冰乙酸,13.,次氯酸钠溶液,14.Ehrlich,氏重氮试剂：,溶液,A,：溶解,5g,亚硝酸钠于,1 000mL,水中。,溶液,B,：溶解,5g,对氨基苯磺酸于,1 000mL,水中。溶解后，再加入,5mL,浓硫酸。,A,、,B,溶液分别保存于密闭瓶内。需用时，以,1,：,1,的比例混合。,二、器材,1.,试管及试管架,2.,水浴锅,3.,酒精灯,4.,滤纸片,5.,烘箱,6.,量筒（,10ml,）,实验注意事项：,1,、本次实验内容繁多，请做好实验报告，并严格按步骤操作。,2,、本次实验是定性实验，各种实验的现象都可能发生，要细心观察。,3,、本次实验有的试剂具强腐蚀性和刺激性，操作时要多加小心。,思考题,1.,如果蛋白质水解作用一直进行到双缩脲反应呈阴性结果，此时可对水解程度作出什么结论,?,2.,能否用茚三酮反应可靠地鉴定蛋白质的存在,?,3.,白明胶对乙醛酸反应呈阴性,为什么,?,