HE染色技术(长沙)课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,临床病理组织染色技术,苏木素伊红染色法,南华大学附属第一医院病理科 赵强,一、概述,苏木素伊红染色即通常所说的普通染色或常规染色，是被广泛经常应用的最基本的染色方法。取苏木精（,Hematoxyln）,和伊红（,Eosin）,两个英文单词中的第一个字母，而简称为,HE,染色。,概 述,HE,染色是生物学尤其是医学领域中的组织学、病理学及细胞学等工作必不可少的最基本染色方法，在临床病理诊断、教学和科研工作中广泛应用，具有重要价值。,HE,染色主要用来显示各种组织正常成分和病变的一般形态结构以及病变的发生、发展、修复的全过程，可进行全面观察。对常规切片染色中难以判定的病变，再做特殊染色进行验证和鉴别。,二、染液及溶液的配制,1、,苏木精染液的配制,2、伊红染液的配制,1、,苏木精染液,苏木精染液的配制方法很多。常规,HE,染色用的苏木精染液多以铝离子作为苏木精的媒染剂。已往用的哈瑞（,Harris）,氏、埃利希（,Ehrlch）,氏、德拉菲尔德（,Delafield）,氏及迈耶（,Mayer）,氏苏木精染液都含钾明矾或铵明矾，故又统称,明矾苏木精,。其实起媒染作用的，即与苏木精色素形成色淀的只是铝离子，而不是钾，也不是铵。有的则用硫酸铝作媒染剂，故宜统称为,铝苏木精染液,。我们在日常工作中，用的是,克拉兹（,Carazzi）,氏改良的苏木精染液 。日本有人将,Carazzi,氏苏木精染液中苏木精及氧化剂的用量增加为2倍或3倍，用于23,m,厚切片的,HE,染色。国内已有报道，效果较好。,克拉兹氏改良的苏木精染液,2倍量 3倍量,苏木精 2,g 3g,蒸馏水 800,ml 800ml,钾明矾 50,g 50ml,碘酸钠 0.4,g 0.6g,甘 油 200,ml 200ml,Mayers,苏木素染液,苏木精 100,mg,蒸馏水 100,ml,碘酸钠 20,mg,硫酸铝铵 5,g,柠檬酸 100,mg,水合氯醛 5,g,用蒸馏水溶解苏木精后，依次加入碘酸钠、硫酸铝铵、柠檬酸和水合氯醛，过滤后存于4冰箱备用。,2、伊红染液的配制,（1）0.250.5%曙红,Y,水溶液,曙红,Y 0.250.5g,蒸馏水100,ml,冰醋酸1滴,（2）0.250.5%曙红,Y,乙醇溶液,曙红,Y0.250.5g,80%,乙醇100,ml,伊红染液的配制,曙红主要是染细胞浆和肌纤维、胶原纤维和红细胞等作为对比染色，染色适中与细胞核相衬，红兰对比鲜明。 在曙红水溶液中加冰醋酸可起促染作用， 但加酸太多，可使曙红沉淀而慢慢失效。,三、,HE,染色的流程,HE,染色流程图（一）,HE,染色流程图（二）,HE,染 色 流 程 图,经过固定的组织取材成小块组织后,10%甲醛,或,AF,液（10%甲醛：95%酒精：冰醋酸=8：1：1）,75%酒精（1.5小时）,85%酒精（1.5小时）,脱水,*,95%酒精2缸（各1小时）,100%,酒精,3,缸（各,1,小时）,二甲苯（2缸，各1小时） 透明,*,石蜡（3缸，各1小时） 浸蜡,*,包埋成蜡块备切片用,包,埋,*,HE,染 色 流 程 图,切片后，烤片（,60,70,1,小时）,贴片、烤,片,*,二甲苯3缸脱蜡（每缸510分钟）,脱蜡,*,梯度酒精（100%、,95%,各2缸和80%1缸，各12分钟）,水化,自来水/蒸馏水洗（5分钟左右）,染苏木素（1030分钟左右）,染色,水洗（洗净苏木素沉渣，时间自定）,1%盐酸酒精13秒钟,分化,*,自来水洗（加点热水冲洗或泡,5,10,分钟）,返蓝,进,95%,酒精或蒸馏水（,2,分钟左右）,伊红（,1,分钟左右）,染色,梯度酒精各1分钟,（,80%1,缸、,95%2,缸、,100% 2,缸）,脱水,二甲苯（,1,缸，35分钟）,透明,*,封片、阅片,*,HE,染 色 流 程 图,四、染色结果,细胞核被苏木素染成鲜明的蓝色，软骨基质、钙盐颗粒呈深蓝色，粘液呈灰蓝色。胞浆被伊红染成深浅程度不同的粉红色至桃红色，胞浆内嗜酸性颗粒呈反光强的鲜红色，胶原纤维呈淡粉红色，弹力纤维呈亮粉红色，红细胞呈橘黄色，核仁呈红色，蛋白性液体呈粉红色。,五、,HE,制片的质量要求,HE,制片是病理医生用作病理诊断的基本和重要的依据之一。,质量好的,HE,染色切片标本，细胞核与细胞浆蓝红相映，鲜艳美丽。胞核鲜明，核膜及核染色质颗粒清晰可见。组织和细胞的一般形态结构特点及很多物质成分均能显示出来。病理技术员的责任就是为病理医生提供高质量的,HE,制片。,一张高质量的,HE,制片要做到：,（1）切片完整、贴片恰当。（2）切片较薄和均匀。（3）无皱折。（4）无刀痕。（5）染色清晰、核浆分明、透明度好。（6）无固缩、龟裂、污染。（7）封胶适当、玻片清洁。（8）标签号码清楚，字体端正。,优良的,HE,染色切片标本，可以长期保存。,在整个染色过程中不让切片干涸,：,切片完全干涸，会使组织收缩和出现裂痕即出现所谓,“,龟裂,”,现象。也会使部分细胞核透明不良，看起来像黑色的细胞核，即形成“黑核”，影响阅片。,福尔马林沉着及“黑核”,HE400,烤片温度过高、风干不彻底,x400,刀痕,x40,封片不当，示气泡,网膜结节冰冻切片,x200,免疫组织化学,免疫组织化学技术，被广泛应用于病理常规诊断中近20来年。随着从多克隆抗体到单克隆抗体、从冰冻切片到常规石蜡切片、从免疫荧光到免疫酶标等一系列技术上的完善，现已经成为病理诊断的常规技术，发挥了其他常规技术无法达到的诊断指导作用（对分化差的恶性肿瘤的鉴别诊断准确率高），因而被病理界称为“棕色革命”（因为酶标显色以棕黄色颗粒为主）,。,免疫组化染色中的常见问题及对策,免疫组化操作方法比较简单，然而在实际工作中也会遇到一些麻烦，如,脱片、无特异性表达或表达较弱、染色过强、背景染色强、定位不好,等。引起上述问题的原因较多，主要有组织固定、脱水不良或浸蜡温度过高导致抗原丢失；抗原未修复；抗体或工作液失效、抗体稀释不当；在一定温度下抗原孵育时间不足、一抗和二抗不匹配；显色剂失效或配置方法失误等。因此，良好的组织固定和脱水及适当的浸蜡温度是做好免疫组化的前提。中性福尔马林固定有利于正确结果的显示。,脱片的可能原因与对策,整批切片脱片,单张切片及整块组织脱片,可能是载玻片未处理，玻片上有油污未清洗或未涂抹防脱片胶，或烤片时间不足致粘片不牢固。,除了上述原因外，需考虑抗体热修复时液体温度过高,和时间过长，或冲洗时用力过猛等因素。,无特异性表达的原因,问 题,确认染色过程次序是否正确；是否忽略了某一过程；是否孵育了足够的时间；是否使用了正确的抗体，以及二抗是否和一抗一致匹配。,底物显色系统是否失效,。,解 决 方 法,重新实验，设立阳性对照，以验证实验结果；仔细确定一抗与二抗种属；,更换显色剂,（,DAB,或,AEC）;,不得使用过期试剂盒，不同批号试剂盒不能混用,；,表达较弱,问 题,标本固定方式不当或固定时温度过高，使部分组织抗原被破坏；,抗原修复方式不当；,抗体浓度过低，或者孵育的温度、时间不够；,冲洗后切片残留多余缓冲液。如果阴性对照没有反应，阳性对照反应良好，而标本弱阳性，应考虑查标本本身原因。,解 决 方 法,新鲜组织及时固定，防止自溶，固定时间不超过24小时；,封闭时间不超过10分钟，或参考产品说明；注意复染时间,提高抗体浓度，孵育时间不少于60分钟（室温低于15，改在37 温箱孵育或4 冰箱过夜）,染色过强,问 题,抗体浓度过高或孵育时间过长,孵育温度过高，37,显色速度过快或显色时间过长；,解 决 方 法,降低抗体浓度、孵育时间；,室温1小时或4过夜；,缩短显色时间；显色时间不超过510分钟，以显微镜下观察为准；,非特异性背景染色,问 题,操作过程中冲洗不充分；,加试剂后切片干燥；,组织切片折叠；,组织中含过氧化物酶未阻断；,组织中含内源性生物素；,组织抗原弥散；,切片粘附剂过厚；,血清蛋白封闭不充分；,解 决 方 法,每步冲洗35；,防止切片干燥（必要时重做）,勿以折叠处观察染色结果；,可配置新鲜3%双氧水封闭，孵育时间延长；,正常非免疫动物血清再封闭；,组织及时固定，固定液要合标准,重新配置粘附剂涂液；,延长血清封闭时间,；,染色定位不好,除,涉及抗体因素外，应注意标本本身的前期处理及具体的操作方法,等。,PR,PR,ER,Cerb,-B2,CD45RO,制作者：南华大学附属第一医院病理科 赵强,谢谢！,组织脱水及目的,组织脱水,就是利用某些能与水相混合的化学试剂泡浸组织，把组织内水分逐步置换出来。,目的：,组织经过水溶性固定液固定和水洗后，其间隙内含有较多水分，因水与二甲苯、石蜡是不能混合的，即使组织间隙内含有极少的水也会阻碍二甲苯和石蜡的渗透，所以未经脱水或脱水不彻底的组织不能直接进入二甲苯透明和石蜡中浸蜡。只有,彻底脱除组织内部水分，才能进行透明、浸蜡、包埋组织，使蜡块能长久保存,。,#,组织透明及目的,组织脱水后，要经过一个浸蜡前的中间溶剂透明过程，才能进行浸蜡。,目的：,组织经脱水后、浸蜡前必须经过某些既能与脱水剂相混合又能溶解石蜡的中间溶剂处理。组织在中间溶剂时，组织间隙内存留的脱水剂完全为中间溶剂所取代时，组织就呈现透明状态，此时即可进行浸蜡。透明液多采用二甲苯，组织经无水乙醇脱水后转入二甲苯透明，组织的大小、厚薄不同，透明时间也不同，一般为3060分钟,。,#,组织浸蜡及注意,点,用于浸蜡的石蜡最好是熔点稍低（5658），低温浸蜡对保存组织细胞内的抗原免疫活性，避免组织收缩和变硬变脆有帮助。根据脱水机配有的蜡缸数量，浸蜡采用二级至四级，以尽量清除二甲苯。不同大小和厚薄的组织浸蜡时间有所不同，一般为13小时。浸蜡温度过高，浸蜡时间过长均可导致组织收缩，变硬变脆，难以切出理想切片,。,#,组织包埋,组织经浸蜡后即可进行包埋。包埋时，包埋石蜡的温度要比组织高（约35），否则包埋冷凝后组织与包埋石蜡分离，特别是在冷天包埋时，动作更要迅速，否则容易导致组织与石蜡融合不好，影响切片。包埋时把组织最大最平切面或所需的病灶切面向下，对皮肤、肠管和囊壁等层次清楚的组织其切面应包含有各层组织。组织包埋完后，蜡块要与取材时记录的组织形状和数量核对，发现问题，及时解决。,#,组织切片,组织切片厚薄要适宜，薄的切片细胞不会重叠，易于观察。切片的厚度应为3,4,，,对一些组织如淋巴结、鼻咽和扁桃体，切片的厚度应为2,3,。,要切出薄而平整的切片需要正确使用切片机，切片前要把切片机上有关的各螺旋拧紧，如没有拧紧切片机上有关的各螺旋，保证切片刀锋利和调至合适的角度。组织蜡块过硬，切片刀或蜡块没固定好，会出现跳刀、切片成一截厚一截薄的现象。,贴片烤片,切出的蜡片（可先放在约1015乙醇内，然后）置恒温水中，这样因水的表面张力比乙醇大，蜡片便容易在温水中展平，根据包埋石蜡的熔点不同，水温约为3942左右。贴片时要注意贴在载玻片中间稍偏右的位置上。对一些组织如皮肤、胃肠等贴片时要注意表皮或粘膜面在下，真皮或肌层在上，方便在镜下观察。贴好片后放入约6065的烤箱内或恒温热板上烤烘1530分钟，使蜡片牢固地粘附在玻片上。烤烘切片的温度一般比包埋石蜡的熔点高5左右。,#,切片脱蜡,切片在染色前必须脱蜡干净，脱蜡不干净会影响组织细胞的着染，即使着染，组织和细胞也会模糊不清。脱蜡一般用两级或三级脱蜡剂如二甲苯，时间为1020分钟。如果脱蜡剂使用多次或室温较低，均需延长脱蜡时间。,#,分化,分化,是把过染的细胞核部分和不应着染苏木精的细胞浆等组织成分脱色，从而使着染的细胞核与细胞浆及细胞周围的组织成分对比清晰。分化时间的长短视组织的性质，切片的厚薄，苏木精染色的深浅和,分化液,（配制,）,的新旧来决定，一般是25秒钟，若切片不分化或分化不足，组织不仅着染细胞核，也着染细胞浆等其他成分，使组织结构对比不清晰；若分化过度，细胞核过淡或褪色。用,Mayers,苏木精染色，通常都不用分化。盐酸乙醇分化后，一般需流水冲冼，避免切片留有盐酸，使细胞核褪色。另一方面苏木精经酸后要经流水冲洗来促兰。流水冲冼一般需1530分钟。如要缩短时间，可用碱性的促兰液来代替流水冲洗。,分化液的配制,0.1%盐酸-乙醇分化液的配制,浓盐酸1,ml,70%,乙醇99,ml,#,切片脱水透明,切片经,HE,染色后，要彻底脱水透明，才能用中性树胶封盖。如果脱水不彻底，封片后呈白色雾状，镜下观察模糊不清，且容易褪色。切片经12级无水乙醇脱水，也可使用石碳酸二甲苯进行脱水。石碳酸有较强脱水能力，但长时间可使切片脱色，因此要经过多次二甲苯以使石碳酸完全除去。,#,封片,切片染色后封片常用中性树胶，酸性的树胶可使胞核褪色，如树胶放置时间过长，因氧化而变酸。中性树胶可用二甲苯稀释。树胶过浓，封片时容易导致气泡；过稀，封片时易使胶外溢，影响美观，也会出现由于二甲苯挥发后缺胶的现象。,*,封片时的注意事项,1、封片时动作快,2、切片入二甲苯后起白雾，为脱水未尽,3、记住切片的组织面,4、防脱片处理,5、盖片必须大于组织块,6、封固剂不要滴得太多，也不要太少，防止气泡产生。,#,