病理学技术的应用课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,病理学常用技术在科研中的应用,广西医科大学第一附属医院病理科,吕自力,病理学常用技术在科研中的应用广西医科大学第一附属医院病理科,1,尸体剖检,autopsy,gold standard,活体组织检查,biopsy,frozen sections.,细胞学检查,cytology,（一）人体病理学的诊断和研究方法,:ABC,（二）实验病理学的研究方法,动物实验,animal experiment,组织和细胞培养,tissue&cell culture,病理学的研究方法,尸体剖检 autopsy,gold standard（一,2,病理学的形态观察方法和新技术,大体观察,组织学和细胞学观察,组织化学和细胞化学,免疫组织化学,超微结构,分子生物学技术,流式细胞术,计算机图象分析技术,qualitative,quantitative,病理学的形态观察方法和新技术大体观察qualitativeq,3,病理学的应用范围,病因学研究,发病学的研究,基本病理变化,揭示疾病的本质、进行病变诊断、分类、分期以及预后判断,药物选择与疗效观察,新药开发,病理学的应用范围 病因学研究,4,内 容,免疫病理学技术,常规,HE,染色及特殊染色,分子病理学技术,内 容免疫病理学技术常规HE染色及特殊染色分子病理学技术,5,一、,HE,染色在科研中的运用,一、HE染色在科研中的运用,6,1,、,HE,染色的用途,1,）组织结构特点,2）细胞形态特点,1、HE染色的用途1）组织结构特点2）细胞形态特点,7,2,、,HE,染色流程,固定取材 脱水,包埋 切片 染色 观察,2、HE染色流程固定取材,8,3,、,HE,染色注意事项,1,）标本采集,组织尽可能多,尽量获取未坏死组织,尽量避免挤压组织,标记标本的方位,3、HE染色注意事项1）标本采集组织尽可能多,9,3,、,HE,染色注意事项,2,）固定,A.,及时固定（离体,30,分钟内）,B.,固定液：,10%,的中性福尔马林固定；,C.,骨髓活检、睾丸活检标本也可用,Bouin,液固定,D.,电镜标本用,2.5%,戊二醛固定,E.,固定液与标本体积比应大于,10,：,1,F.,固定时间：,2-4,小时（小），,12-24,小时（大）,3、HE染色注意事项2）固定A.及时固定（离体30分钟内）,10,二、特殊染色在科研中的应用,1、目的,1）识别病原体：HP,抗酸，PAS,二、特殊染色在科研中的应用1、目的,11,特殊染色的用途,2）识别组织：Masson,VG,PAS,特殊染色的用途2）识别组织：Masson,VG,PAS,12,三、免疫组织化学,Immunohistochemistry,IHC,原 理,使用范围,试剂配置,操作步骤,三、免疫组织化学Immunohistochemistry,13,免疫组织化学的原理,抗原,+,抗体,-,显色,原位,半定量,蛋白,免疫组织化学的原理抗原+抗体-显色原位半定量,14,用途,临床病理诊断：肿瘤分类诊断,上皮来源：,CK,，,EMA,间叶来源：,Vimentin,淋巴组织,:LCA,科研：组织抗原表达情况,用途临床病理诊断：肿瘤分类诊断,15,试剂准备,切片,(,防脱片,),多聚赖氨酸,APES,一抗,多抗,or,单抗,兔,or,鼠,注意种属特异性，针对检测组织种属,检测试剂盒,EliVisionTM plus,检测试剂盒（二步法）,SP,试剂盒（三步法）,SABC,试剂盒（三步法）,显色试剂盒,DAB,试剂盒,其他,H2O2,，二甲苯，酒精，缓冲液（,PBS,，柠檬酸缓冲液），抗原修复液（胰酶），正常动物非免疫血清,试剂准备切片(防脱片)多聚赖氨酸,APES一抗多抗or单抗,16,操作步骤,组织切片脱蜡，水化,PBS,洗,3,次,X 3,分钟,抗原修复,一抗（,37,度,1h,，,4,度过夜）,封闭内源性过氧化物酶,PBS,洗,3,次,X 3,分钟,二抗（,37,度,30,分钟）,PBS,洗,3,次,X 3,分钟,苏木素染核,自来水洗,DAB,显色,脱水,封片,PBS,洗,3,次,X 3,分钟,操作步骤组织切片脱蜡，水化PBS洗3次 X 3分钟抗原修复一,17,结果分析和判断,结果分析和判断,18,阴性,阴性,19,CK,胞浆阳性,CK胞浆阳性,20,细胞核阳性,-PCNA,细胞核阳性-PCNA,21,胞膜阳性,胞膜阳性,22,注意事项,（1）判断原则,（2）对照设计,（3）非特异染色,（4）失败的原因及其处置方法,注意事项（1）判断原则,23,（,1,）判断原则,必须设立染色对照：阴性对照，阳性对照,抗原表达必须在特定部位：胞膜、核、浆,尽量避开出血、坏死及切片刀痕和界面边缘细胞的阳性表达,对免疫组化标记结果的意义不能绝对化,（1）判断原则必须设立染色对照：阴性对照，阳性对照,24,（,2,）对照设计,阳性对照：已知阳性表达的组织,自身对照：同一标本中不同组织对照,阴性对照：,A,、阴性组织对照：已知阴性表达的组织,B,、阴性试剂对照：空白对照,（2）对照设计阳性对照：已知阳性表达的组织,25,（,3,）非特异性染色,原因,组织内源性成分的干扰：,内源性过氧化物酶,-,白细胞，红细胞,内源性生物素,-,肝、胰、肾组织,组织处理不当：,内源性过氧化物酶,-,白细胞，红细胞,内源性生物素,-,肝、胰、肾组织,（3）非特异性染色原因组织内源性成分的干扰：组织处理不当：,26,（,3,）非特异性染色,处理方法,抗体：纯化，浓度，时间，温度,封闭：,H2O2,，非免疫动物血清,清洗：充分,显色：时间,其他：脱蜡充分，无干片,（3）非特异性染色处理方法抗体：纯化，浓度，时间，温度封闭：,27,（,4,）染色失败的原因及处理方法,试验片：-,阳性对照片：-,阴性对照片：-,空白对照片：-,结果：假阴性,原因：,操作步骤？,试剂？,（4）染色失败的原因及处理方法试验片：-结果：假阴性原因：,28,试验片：,+,阳性对照片：,+,阴性对照片：,+,空白对照片：,+,结果：假阳性,原因：,切片干涸,抗体浓度过高,缓冲液配制不对,冲洗不彻底,显色液配制不对,显色时间过长,载玻片的粘合剂过厚,试验片：+结果：假阳性原因：,29,试验片：,+,阳性对照片：,+,阴性对照片：,-,空白对照片：,+,结果：假阳性,原因：,非特异染色，与二抗交叉反应。,试验片：+结果：假阳性原因：,30,试验片：,+,阳性对照片：,+,阴性对照片：,+,空白对照片：,-,结果：可疑阳性,原因：,阴性对照组织选择不准确，含有靶抗原,试验片：+结果：可疑阳性原因：,31,试验片：,+,阳性对照片：,+,阴性对照片：,-,空白对照片：,-,结果：阳性,原因：,方法可靠，实验片含靶抗原。,试验片：+结果：阳性原因：,32,阴性对照切片,-,，阳性对照标本和待检测切片呈弱阳性,原因：,标本固定不当,抗体试剂问题：浓度、效价低,抗原修复不当,显色时间短,阴性对照切片-，阳性对照标本和待检测切片呈弱阳性原因：,33,切片染色深或整张切片出现染色,抗体浓度过高,切片显色时间过长,组织没有正确封闭,冲洗不够充分,切片染色深或整张切片出现染色抗体浓度过高,34,切片出现非特异性背景染色,内源性过氧化物酶、内源性生物素过多,血清封闭时间过短,抗体不纯,组织片内出血或坏死成分,冲洗不彻底,切片出现非特异性背景染色内源性过氧化物酶、内源性生物素过多,35,四、免疫荧光技术,将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，从而可对 抗原进行细胞定位,四、免疫荧光技术将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技,36,免疫荧光技术,免疫荧光技术,37,五、分子生物学技术,原位杂交,五、分子生物学技术原位杂交,38,分子生物学技术,原位杂交和原位,PCR,HPV DNA&CK,分子生物学技术HPV DNA&CK,39,组织芯片,组织芯片,40,HE,组织芯片,免疫学,特染,病理学技术,杂交,HE组织芯片免疫学特染病理学技术杂交,41,病理学技术的应用课件,42,病理学技术的应用课件,43,