11第十一章抗生素类药物分析剖析

单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,新疆石河子大学药学院,第十一章 抗生素类药物的分析,新疆石河子大学药学院李乐,中 国 石河子大学药学院,在卑微浓度下即可对某些生物病原微生物的生命活动有特异抑制作用的化学物质的总称,内酰胺类,氨基糖苷类,四环素类,大环内酯类,多烯大环类,多肽类,1. 抗生素antibiotics,2. 分 类,新疆石河子大学药学院,一、概 述,化学纯度较低,活性组分易发生变异,稳定性差,3. 来 源,4. 抗生素的特点,化学合成,半合成,生物合成（发酵）,生产工艺简洁,发酵过程不易把握，易受污染,缘由,石河子大学药学院,一、概 述,承受生物学法与物理化学法,鉴别：理化方法、微生物法,检查：水分、特殊毒性、热原、细菌内毒素、降压物质等,含量/效价测定：,微生物法 ：,与临床疗效吻合，灵敏度高，但操作简洁费时；,理化方法：,准确度与专属性较高，且操作简便，但与临床疗效有偏差,5. 抗生素养量分析,一、概 述,石河子大学药学院,1. 化学构造,包括青霉素类和头孢菌素类,青霉素类：6-,APA,为母核 头孢菌素类：7-,ACA,为母核,石河子大学药学院,二、,内酰胺类,酸性较强pKa 2.5-2.8,临床常用其碱金属盐,水溶性好,酸性(羧基),有多个手性碳,旋光性,青霉素类：苯环取代基,头孢菌素类：母核有共轭构造,UV共轭,枯燥条件较稳定，溶液不稳定,稳定性(内酰胺),2、主要,理化性质,降解,失效,氧化剂、酸、碱,酶、金属离子、,青霉素,石河子大学药学院,二、,内酰胺类,2、,主要理化性质,石河子大学药学院,二、,内酰胺类,1羟肟酸铁反响：,内酰胺类 羟肟酸 显色,2茚三酮反响,-氨基 蓝紫色,3双缩脲反响,内酰胺类 紫色,4光谱法UV、NMR,5色谱法HPLC、TLC,NH,2,OH,HCl,NaOH,Fe,3+,H,+,茚三酮,碱性酒石酸铜,呈色反响,3,、,鉴 别,石河子大学药学院,二、,内酰胺类,3,、,鉴 别,-,头孢利定的,NMR,鉴别法,(,JP14),NMR,鉴别法,单峰信号,取本品50,mg,溶于0.5,ml,重水中，测定,NMR,光谱时，应显示,多重峰信号,多重峰信号,= 3.8 四周,= 6.97.5,= 7.99.0,2,3,5,强度比,二、,内酰胺类,3,、,鉴 别,-,头孢氨苄鉴别的,TLC,条件,CHP2023,5,mg/ml 2l,硅胶,G,0.1mol/L,枸橼酸液-0.2,mol/LNa2HPO4-,丙酮 (120:80:3),0.1% 茚三酮溶液显色,USP24,25,mg/ml 5l,硅胶,醋酸乙酯-水-乙腈-冰,HAc (48:18:14:14),短波长,UV,光检出,BP1999,0.4%(,W/V) 1l,硅烷化硅胶,HF254,15.4% NH4Ac(pH6.2)-,丙酮(85:15),254,nm,检出,二、,内酰胺类,4、特殊杂质检查-聚合物、有关物质、异构体等,色谱条件与系统适用性试验,测定法,头孢他啶中聚合物测定,头孢呋辛酯中,有关物质和异构体的检查,色谱条件与系统适用性试验,异构体和有关物质,举 例：,二、,内酰胺类,头孢他啶中聚合物测定,-,色谱条件与系统适用性试验,葡聚糖凝胶,G-10,理论板数应不低于900，,拖尾因子在0.751.5,254,nm,检 测,流淌相A：,含3.5%硫酸铵,的0.01mol/L,磷酸盐缓冲液,蓝色葡聚糖,2023,头孢他啶中聚合物测定,-,色谱条件与系统适用性试验,葡聚糖凝胶,G-10,峰面积的,RSD,应小于5.0%,254,nm,检 测,流淌相B：,0.01%十二烷基,硫酸钠溶液,头孢他啶,比照品溶液,头孢他啶中聚合物测定,-,测定法,葡聚糖凝胶,G-10,254,nm,检 测,流淌相A：,含3.5%硫酸铵,的0.01mol/L,磷酸盐缓冲液,头孢他啶样品,20mg/ml,外标法计算，本品含头孢他啶聚合物以头孢他啶计不得超过0.3%,A,S,头孢他啶中聚合物测定,-,测定法,葡聚糖凝胶,G-10,254,nm,检 测,流淌相B：,0.01%十二烷基,硫酸钠溶液,头孢他啶,比照品溶液,A,R,外标法计算，本品含头孢他啶聚合物以头孢他啶计不得超过0.3%,头孢呋辛酯中,有关物质和异构体,的检查,头孢呋辛酯A，B异构体之间、头孢呋辛酯A异构体与头孢呋辛酯2-异构体之间的分别度应大于1.5；,色谱条件,：,ODS分析柱；,0.2mol/L磷酸二氢铵-甲醇62:38为流淌相；,流速1ml/min；,检测波长278 nm。,系统适用性试验,：,理论板数按头孢呋辛酯,A,异构体峰计算，应不低于1500。,40,0,20,60,0,30,20,10,时间(,min),峰高(,mAU),6,5,4,A,异构体,B,异构体,1,13.954,11.919,2.401,B异构体峰的相对保存时间约为0.85，,A异构体峰的相对保存时间为1.0。,供试品色谱图中,A异构体峰的面积与A、B异构体峰的面积和之比应为0.480.55。,头孢呋辛酯中,有关物质和异构体,的检查,异构体,供试品溶液：0.2mg/ml(流淌相溶,比照溶液:供试品溶液，加流淌相稀释成6g/ml,比照溶液进样20l ，调整仪器灵敏度，使主成分峰高约为记录仪满量程的10%,取供试品溶液和比照品溶液各20l，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主峰保存时间的2.5倍,供试品溶液如显杂质峰，量取各杂质峰面积的和，不得大于比照溶液主峰的面积,头孢呋辛酯中,有关物质和异构体,的检查,有关物质,5、含量测定,-碘量法ChP2023,二、 内酰胺类,原理：青霉素与头孢菌素本身不与碘反响，但其碱性降解产物可消耗碘,青霉素族,头孢菌素族,NaOH,水解,4,I,2,H,+,8,I,-,I,2,+2Na,2,S,2,O,3,2NaI + Na,2,S,4,O,6,定量过量,剩 余,5,、,含量测定,-碘量法ChP2023,反响分两步进展：,水解反响 (按化学计算量进展),氧化-复原反响 (无定量关系，受温度、pH值和时间等因素影响，,应严格把握反响条件并承受标准品平行比照测定),5,、,含量测定,-碘量法ChP2023,因样品中杂质会消耗碘，故应作空白试验。,参与样品，不加碱；,其余试剂醋酸盐缓冲液，碘液，硫代硫酸钠都要加碱。,空白试验:,空白试验与经典空白试验不同：,5,、,含量测定,-碘量法ChP2023,试验条件:I2氧化,弱酸性pH4.5,20分钟后，,耗碘量随时间的变化较小,碱,I,2, IO,3,-,+ I,-,酸 某些药物与碘生成复盐沉淀,温度2426,温度,38,时,未水解的供试品亦消耗碘,反响时间： 20分钟,5,、,含量测定,-碘量法ChP2023,含量 比照品,V,样空,-,V,样,W,对,V,对空,-,V,对,W,样,灵敏度高：样品 : 碘 = 1 : 8,反响条件、试验操作要求高,1份含量,V,对,、,V,对空,V,样,、,V,样空,加试剂次序、反响时间、滴定速度一样,特 点：,5,、,含量测定,-电位配位滴定法汞量法,原理：青霉素不与汞盐反响，其碱性降解产物可与Hg2+络和。,Hg,+,+ 2R-SH (RS),2,Hg + 2H,+,方法说明：,a、空白试验与碘量法类似，加样品，不加NaOH,b、与碘量法相比，汞量法不需比照试验,5,、,含量测定,-,其他常用方法,酸碱滴定法：应用广泛,硫醇汞盐法,羟肟酸比色法,HPLC,法：应用广泛,咪唑,HgCl,2,（,max,324345nm）,青霉素 青霉烯酸硫醇汞盐,NH,2,OH,H,+,Fe,3+,内酰胺类 红色,5,、,含量测定,例-阿莫西林克拉维酸钾片,填充剂,流动相,检测波长,峰形,阿莫西林峰与克拉维酸峰的分别度应大于3.5,色谱条件与系统适用性试验,十八烷基硅烷键合硅胶,磷酸盐缓冲液-甲醇(95:,5,),流速为0.7,ml/min；,检测波长为220,nm,5,、,含量测定,例-阿莫西林克拉维酸钾片,取本品10片，置1000ml量瓶中，加水适量，振摇使溶解，加水稀释至刻度，摇匀，周密量取10ml，置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液10l注入液相色谱仪，记录色谱图；,另取阿莫西林比照品与克拉维酸比照品各适量，加水溶解，制成每1ml中含阿莫西林0.5mg和克拉维酸0.25mg的混合溶液，同法测定。,按外标法以峰面积分别计算供试品中C16H19N3O5S和C8H9NO5的含量。,测 定 法 ：,1. 化学构造,三,、,氨基糖苷类,都是以氨基环醇与氨基糖缩合而成的苷；,分子构造中都含有多羟基；,均为碱性抗生素；,链霉素,临床应用其硫酸盐,碱性(氨基),糖：有多个手性碳,旋光性(糖),水 溶 性,溶解度(氨基、羟基),强酸、碱条件均可水解,稳定性(苷),2、主要,理化性质,三,、,氨基糖苷类,3,、,鉴 别,三,、,氨基糖苷类,茚三酮反响：具羟基胺类，-氨基酸性质,链霉素 +,水和茚三酮 蓝紫色,链霉素,N-,甲基葡萄糖胺,N-甲基葡萄糖胺Elson-Morgan反响：,红 色,水解,对二甲氨基苯甲醛,乙酰丙酮,OH,-,OH,-,重排,Fe,3+,8-羟基喹啉,NaOBr,OH,-,水解,坂口Sakaguchi反响：(链霉胍特有,麦芽酚Maltol)反响：(链霉糖特有,三,、,氨基糖苷类,-鉴别,链霉素 麦芽酚 紫红色,链霉素 链霉胍,橙红,硫酸盐反响,或,-,萘酚,4,、,检 查,-,来 源：,发酵中产生,BP:,薄层色谱法杂质比照品法,要求：NC2 2023，C2a峰和C2峰的分别度应符合要求，重复进样RSD2.0%,三,、,氨基糖苷类,链霉素中链霉素,B,的检查,庆大霉素C 组分测定系统适用性试验,色谱柱：,ODS,流淌相： H2O-HAc-MeOH配制的庚烷磺酸钠溶液(0.2M)，必要时调整甲醇的含量。,检测波长：,330nm邻苯二甲醛柱前衍生,4,、,含 量 检 测,三,、,氨基糖苷类,氨基糖苷类 含量检测,微生物法、,HPLC,法等,四,、,四环素类,1. 化学构造,四,、,四环素类,-,OH：,酸性,N(CH,3,),2,：,碱性,与酸、碱均可成盐,临床多用盐酸盐,两 性,旋光性,易发生异构化，降解等反响，性质不稳定,稳定性,酚羟基、烯醇基与,Ca,2+,、Mg,2+,络合显色,与金属离子络合,2、主要,理化性质,UV,和荧光,四,、,四环素类,2,.,主要理化性质,碱 性,C,环开环，形成内酯 异四环素,弱酸性pH2-6 A环C-4异构化 差向四环素,酸性pH 2 C环脱水 脱水四环素,四,、,四环素类,A,A,pH2.06.0,差向异构体,D,D,D,C,B,B,C,B,C,脱水四环素类,异四环素,OH,-,四,、,四环素类,四,、,四环素类,3,.,鉴 别,1浓硫酸反响,2FeCl3反响： 酚羟基 显红色褐色,3 TLC、HPLC,4荧光：含共轭双键紫外灯照射下产生不同颜色荧光,ChP、USP,： HPLC,法,JP,：,比色法,4,.,检 查,TLC、HPLC法,杂质吸取度降解产物颜色较深,5,.,含 量,五,、,高分子杂质的检查,内源性：药物自身聚合物,来源于生产过程、贮存过程、使用不当,外源性：蛋白、多肽、多糖及其与药物的结合物,来源于发酵过程,临床应用其硫酸盐,高分子杂质,凝胶色谱法：葡聚糖凝胶,Sephadex G-10,杂质把握方法,