大肠埃希氏菌重点

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,大肠埃希氏菌药典法生化,(shn hu),检查,潘庆玲,第一页，共二十七页。,大肠,(dchng),埃希菌检查,大肠埃希菌（Escherichia coil）即大肠杆菌，为肠杆菌科埃希菌属的模式种。大肠埃希菌是人和温血动物肠道内的栖居菌，随粪便排出体外。在药品中检出大肠埃希菌，表明该样品受到人和温血动物粪便的污染，即可能是污染肠道病原体。大肠埃希菌除普通大肠埃希菌外，还有致病性大肠埃希菌，可引起婴幼儿、成人爆发性腹泻。为了,(wi le),保证人体健康，口服给药制剂必须检查大肠埃希菌。,第二页，共二十七页。,标准,(biozhn),中国药典（2010年版）二部,口服给药制剂,细菌,(xjn),总数每1ml不得过100cfu,霉菌和酵母菌总数每1ml不得过100cfu,大肠埃希菌总数不得检出,第三页，共二十七页。,备料,(bi lio),单（增菌培养）,序号,品名,规格,数量,备注,1,锥形瓶,250ml,4,2,刻度吸管,10ml,2,3,刻度吸管,1ml,1,4,烧杯,250ml,1,5,量筒,100ml,1,6,胆盐乳糖培养基,100ml,3,装锥形瓶,7,pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液,150ml,1,装锥形瓶,灭菌,(mi jn),参数：121、20min,第四页，共二十七页。,操作过程,样品,10ml,90ml,供试液,稀释液,阴,样,阳,10ml,10ml,10ml,菌悬液,1ml,BL培养基,BL培养基,BL培养基,培养温度,(wnd),：36,培养时间：1824h（必要时可延长至48h）,第五页，共二十七页。,备料,(bi lio),单（快速生化试验）,序号,品名,规格,数量,备注,1,刻度吸管,1ml,3,2,试管,中,4,3,MUG培养基,5ml,4,分装到试管中,4,靛基质,灭菌,(mi jn),参数：115、20min,第六页，共二十七页。,操作过程,阴,样,阳,阴,样,阳,本底,靛基质试验,紫外荧光,0.2ml,0.2ml,0.2ml,培养温度,(wnd),：361,培养时间：1824h,第七页，共二十七页。,备料,(bi lio),单（分离培养）,序号,品名,规格,数量,备注,1,EMB或麦康凯琼脂培养基,60ml,1,置皿,2,平皿,3,灭菌,(mi jn),参数：121、15min,第八页，共二十七页。,操作过程,阴,样,阳,EMB或麦康凯琼脂培养基,接种环（四区划线法）,培养温度,(wnd),：361,培养时间：1824h,第九页，共二十七页。,生化,(shn hu),试验中MUG在紫外等下显荧光的原理,大肠埃希氏菌是指能产生-半乳糖苷酶分解,(fnji),ONPG使培养液呈黄色，能产生-葡萄糖醛酸酶分解,(fnji),MUG使培养液在波长366nm紫外光下 产生荧光的细菌。,第十页，共二十七页。,BL,培,培养,基,基,配方,(p,if,ng),（每,升,升）,：,：,胨20.0g,提,提,供,供碳,氮,氮源,乳糖5.0g,可,可发,酵,酵的,糖,糖类,氯化,钠,钠5.0g,维,维持,均,均衡,的,的渗,透,透压,磷酸,氢,氢二,钾,钾4.0g,缓,缓冲,剂,剂,磷酸,二,二氢,钾,钾1.3g,去氧,胆,胆酸,钠,钠/,牛,牛胆,盐,盐0.5g/2.0g,选,选,择,择性,抑,抑菌,剂,剂,第十,一,一页,，,，共,二,二十,七,七页,。,。,使用,(shyng),方法,1、,称,称取,本,本品35.8g，,加,加入,蒸,蒸馏,水,水或,去,去离,子,子水1L，,搅,搅拌,加,加热,煮,煮沸,至,至完,全,全溶,解,解，,分,分装,三,三角,瓶,瓶，,每,每瓶100mL，121,灭,灭菌20min，,待,待冷,至,至常,温,温后,，,，备,用,用。2,、,、样,品,品的,处,处理,。,。略,。,。3、,取,取胆,盐,盐乳,糖,糖增,菌,菌液3份,，,，2,份,份分,别,别加,入,入规,定,定量,的,的供,试,试液,，,，其,中,中一,份,份加,入,入对,照,照菌50,100,个,个作,阳,阳性,对,对照,，,，第,三,三份,加,加入,与,与供,试,试液,等,等量,的,的稀,释,释液,作,作阴,性,性对,照,照。4,、,、将,三,三角,瓶,瓶放,入,入3035,恒,温,温培,养,养箱,内,内培,养,养1824h。,必,必要,时,时可,延,延长,至,至48h,。,。5、,观,观察,结,结果,。,。阳,性,性对,照,照应,生,生长,(shngzh,ng),良好,，,，阴,性,性对,照,照应,无,无菌,生,生长,(shngzh,ng),。,质量,控,控制,：,：本,品,品质,控,控菌,株,株接,种,种后,，,，于36,1,培,养,养1824h，,培,培养,结,结果,肉,肉汤,呈,呈混,浊,浊。,第十,二,二页,，,，共,二,二十,七,七页,。,。,MUG培,养,养基,配方,（,（每,升,升）,：,：,胰蛋,白,白胨20.0g,提,提供,碳,碳氮,源,源,3号,胆,胆盐1.5g,抑,抑,制,制革,兰,兰氏,阳,阳性,菌,菌,乳糖,(r,tn),5.0g,可,可,发,发酵,的,的糖,类,类,磷酸,氢,氢二,钾,钾4.0g,缓,缓,冲,冲剂,磷酸,二,二氢,钾,钾1.5g,氯化,钠,钠5.0g,维,维,持,持均,衡,衡的,渗,渗透,压,压,MUG0.05g,第十,三,三页,，,，共,二,二十,七,七页,。,。,使用,(shyng),方法,1、,称,称取,本,本品37.05g,，,，加,入,入蒸,馏,馏水,或,或去,离,离子,水,水1L,，,，搅,拌,拌加,热,热煮,沸,沸至,完,完全,溶,溶解,，,，分,装,装于,带,带有,小,小倒,管,管的,试,试管,中,中，115,高,高压,灭,灭菌20min，,待,待冷,至,至常,温,温，,备,备用,。,。2、,将,将总,大,大肠,菌,菌群,多,多管,发,发酵,法,法初,发,发酵,产,产酸,或,或产,气,气的,管,管进,行,行大,肠,肠埃,希,希氏,菌,菌检,测,测。,用,用烧,灼,灼灭,菌,菌的,金,金属,接,接种,环,环或,无,无菌,棉,棉签,将,将上,述,述试,管,管中,液,液体,接,接种,到,到EC-MUG肉,汤,汤管,中,中。3,、,、将,已,已接,种,种的EC-MUG,管,管在,培,培养,箱,箱或,恒,恒温,水,水浴,中,中44.50.5,培,培养24h2h,。,。如,使,使用,恒,恒温,水,水浴,，,，在,接,接种30min内,进,进行,培,培养,，,，水,浴,浴箱,的,的液,面,面应,高,高于EC-MUG,肉,肉汤,液,液面,。,。4、,观,观察,(gunch),结果,：,：将,培,培养,基,基管,置,置366nm,紫,紫外,灯,灯下,约,约5cm,处,处，,以,以未,接,接种,培,培养,物,物的EC-MUG,培,培养,基,基作,空,空白,对,对照,，,，观,察,察,(gunch),有无蓝白,色,色荧光。,空,空白对照,管,管应无蓝,白,白色荧光,，,，试验管,出,出现蓝白,色,色荧光为,阳,阳性反应,。,。,质量控制,：,：大肠埃,希,希菌菌株,接,接种后于361,培养1824h，结果,产,产气，紫,外,外灯下显,荧,荧光。,第十四页,，,，共二十,七,七页。,EMB琼,脂,脂,(qingzh,),培养基,配方（每,升,升）：,胨10.0g,提,提供氮源,、,、维生素,、,、氨,牛肉浸出,(jnch),粉3.0g,基,基酸和,碳,碳源,氯化钠5.0g,维,维持,均,均衡的渗,透,透压,乳糖10.0g,可,可发酵的,糖,糖类,琼脂14.0g,培,培养基凝,固,固剂,曙红钠0.4g,抑,抑菌,剂,剂（革兰,氏,氏阳性菌,）,）,亚甲蓝0.065gpH指示,剂,剂,在酸性条,件,件下产生,沉,沉淀，形,成,成紫黑色,菌,菌落或具,黑,黑色中心,的,的外围无,色,色透明的,菌,菌落。,第十五页,，,，共二十,七,七页。,使用,(shyng),方法,1、称取,本,本品42.5g，,加,加入蒸馏,水,水或去离,子,子水1L，搅拌,加,加热煮沸,至,至完全溶,解,解，分装,三,三角瓶，121,高,高压灭菌15min。2,、,、待培养,基,基冷至50左右,，,，以无菌,手,手续，倾,注,注灭菌平,皿,皿，待凝,固,固后，备,用,用。3,、,、将供试,液,液划线接,种,种于平板,上,上。4,、,、将平板,翻,翻转，放,入,入恒温培,养,养箱中，3035培养1824h。5、观察,结,结果。,质量,(zhling),控制：本,培,培养基倾,注,注平皿待,冷,冷却后呈,紫,紫色，可,有,有细微沉,淀,淀。大肠,埃,埃希菌菌,株,株接种后,。,。361培养1824h，,培,培养结果,呈,呈黑心，,有,有绿色金,属,属光泽。,第十六页,，,，共二十,七,七页。,麦康凯琼,脂,脂,(qingzh,),培养基,配方（每,升,升）,胨20.0g,碳,碳氮,源,源、维生,素,素和生长,因,因子,牛胆盐5.0g,抑,抑制,革,革兰氏阳,性,性菌的生,长,长,氯化钠5.0g,维,维持,均,均衡的渗,透,透压,琼脂14.0g,培,培养基的,凝,凝固剂,乳糖10.0g,可,可发酵的,糖,糖类,中性红0.03gpH,指,指示剂,细菌,(xj,n),发酵乳糖,产,产酸时菌,落,落呈粉红,色,色并在菌,落,落周围出,现,现胆盐沉,淀,淀的浑浊,圈,圈。,第十七页,，,，共二十,七,七页。,使用,(shyng),方法,1、称,取,取本品54.0g,，,，加入蒸,馏,馏水或去,离,离子水1L，搅,拌,拌加热煮,沸,沸至完全,溶,溶解，分,装,装三角瓶,，,，121,高压灭,菌,菌15min。2、待培,养,养基冷至5055倾注,灭,灭菌平皿,，,，待凝固,后,后，备用,。,。3、,取,取待检样,品,品划线接,种,种于麦康,凯,凯平板。4、将,平,平板置培,养,养箱于3035,培养1824h。5,、,、观察结,果,果。在做,致,致泻大肠,埃,埃希氏菌,检,检验时，,观,观察结果,不,不但要注,意,意乳糖发,酵,酵的菌落,，,，同时也,要,要注意不,发,发酵和迟,缓,缓,(chhun),发酵的菌,落,落。,质量控制,：,：大肠埃,希,希菌菌株,经,经361培养1824h菌落,特,特征呈粉,红,红或红，,周,周围有混,浊,浊胆盐沉,淀,淀圈。,第十八页,，,，共二十,七,七页。,IMViC,用来测定,(cd,ng),菌的生理,生,生化特征,的,的4个实,验,验.,I:吲哚,试,试验,M:甲基,红,红试验,V:V.P试验,C:柠檬,酸,酸实验,i是为个,好,好读加上,去,去的,第十九页,，,，共二十,七,七页。,吲哚,(yndu),（indole）,实,实验,原理：有,些,些细菌如,大,大肠埃希,菌,菌、变形,杆,杆菌、霍,乱,乱弧菌等,能,能分解,(fnji),培养基中,的,的色氨酸,生,生成吲哚,（,（靛基质,）,），经与,试,试剂中的,对,对二甲基,氨,氨基苯甲,醛,醛作用，,生,生成玫瑰,吲,吲哚而呈,红,红色，是,为,为吲哚试,验,验阳性。,试验菌,用,用蛋白胨,水,水培养基37培,养,养24小,时,时.,在培养,液,液中加入,乙,乙醚1ml(使呈,明,明显的乙,醚,醚层)充,分,分振荡,使,使吲哚试,剂,剂溶于乙,醚,醚.静置,片,片刻,待,乙,乙醚浮于,培,培养液上,面,面时沿管,壁,壁慢慢加,入,入吲哚试,剂,剂10滴.呈玫瑰,红,红的为阳,性,性,不变,色,色的为