血浆蛋白质醋纤膜电泳

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,血浆蛋白质 醋酸纤维素薄膜电泳,（Electrophoresis on cellulose acetate membrane of serum proteins),实验2,实验目的,1、掌握醋酸纤维素薄膜电泳的原理,2、掌握醋酸纤维素薄膜电泳分离血浆蛋白质,的实验操作技术和注意事项。,3、了解醋酸纤维素薄膜作支持物进行电泳,的优点及使用范围。,醋酸纤维素薄膜电泳,采用醋酸纤维素薄膜作为支持物的电泳方法叫做,醋酸纤维素薄膜电泳,。,醋酸纤维素是纤维素的羟基乙酰化所形成的纤维素醋酸酯，将它溶于有机溶剂（如丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均匀的薄膜，干燥后就成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状结构，厚度约为120m，通透性好，对分子移动阻力少，是一种良好的电泳支持物。,醋酸纤维素薄膜电泳的优点及应用,具有微量、快速、简便、区带清晰、灵敏度高、便于摄影和保存等优点。,用于科学实验、生化产品分析和临床化验，如血浆蛋白、血红蛋白、球蛋白、脂蛋白、糖蛋白、甲胎蛋白、同工酶等的分离鉴定。,原 理,血浆中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于pH7.4。它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。由于血浆中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，因而在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。因此可以将它们分离为,清蛋白（Albumin)、,1,-球蛋白、,2,-球蛋白、-球蛋白、-球蛋白，纤维蛋白原,条区带。,血浆蛋白质的等电点、平均相对分子量、及正常含量,球 蛋 白,清蛋白,A,1,2,pI,相对分子量,（10,4,）,含量（%）,4.88,6.9,5772,5.06,20,25,5.06,30,49,5.12,915,6.212,6.857.3,15.630,1220,实验材料,健康人血浆或动物血浆,试剂,1、pH8.6巴比妥缓冲液,2、氨基黑10B染色液,3、漂洗液,4、洗脱液,5、透明液,（试剂配制参见实验讲义）,定量时用,仪器和器材,1、常压电泳仪、电泳槽,2、醋酸纤维素薄膜（28cm）,3、点样器（载玻片或盖玻片）、玻璃板,4、培养皿（泡膜、染色和漂洗用）,5、滤纸,6、镊子,7、试管、试管架、吸量管,8、分光光度计,（定量用）,操作步骤,1、薄膜准备,将醋酸纤维素薄膜切成28cm的小条。,在薄膜粗面一端1.5cm处用铅笔轻轻画一横线。,在薄膜角上用铅笔作一标记。,将醋酸纤维素薄膜浸泡于缓冲液中20min。,操作步骤,醋酸纤维素薄膜规格及点样位置,8cm,2cm,点样线,点样区,1.5cm,(粗面）,操作步骤,2、电泳仪准备,在电泳槽内加入缓冲液，使两个电极槽内的液面等高。先剪裁尺寸合适的滤纸条，取双层滤纸条附着在电泳槽的支架上，使它的一端与支架的前沿对齐，而另一端浸入电极槽的缓冲液内。用缓冲液将滤纸全部润湿并驱除气泡，使滤纸紧贴在支架上，即为滤纸桥。它是联系醋酸纤维薄膜和两极缓冲液之间的“桥梁”。,操作步骤,3、点样（电泳的关键步骤）,用镊子把膜条从缓冲液中取出，夹在两层滤纸中间，吸去多余的液体，然后平铺在玻璃板上（粗面朝上），将点样器先在培养皿的血浆中沾一下，再在膜条点样线处,轻轻地水平落下并随即提起,，这样即在膜条上点上了细条状的血浆样品。,点样线,尽量点得细窄而均匀。宁少勿多。,操作步骤,4、上槽,待血浆吸入膜后，以薄膜,粗面向下,、,点样端置阴极端,，两端紧贴在滤纸盐桥上，,膜应轻轻拉平,，加盖，平衡约5min，使薄膜渗透的缓冲液达到平衡。,切勿使点样处与电泳槽接触,醋酸纤维素薄膜电泳装置示意图,操作步骤,5、电泳,检查电泳装置是否正确，开启电源，调节电压、电流，然后通电4060min。,电压：110150V（10V/cm膜长）,薄膜的有效长度是两电极缓冲液面之间滤纸盐桥和薄膜的长度之和。,电流：0.40.6mA/cm膜宽,有数条膜便求数条膜宽的总和。,操作步骤,6、染色和漂洗,电泳完毕后，关闭电源，将膜取出，直接浸于染色液中5min。,取出膜，,尽量沥净染色液,，移入漂洗液中浸洗脱色（一般更换23次），,至背景颜色脱净为止,。,取出膜，用滤纸吸干即可。,操作步骤,血浆蛋白醋酸纤维素薄膜电泳图谱,电泳方向,A,1,2,纤维蛋白原,操作步骤,7、透明,薄膜完全干燥后，浸入透明液中20min后，取出平贴在玻璃板上（不要留有气泡），完全干燥后即成透明的薄膜图谱，要作扫描或照相用。可长期保存。,操作步骤,8、定量（略）,洗脱比色法,光密度计扫描法,血清蛋白电泳,光密度扫描,同工酶：,催化相同化学反应，而蛋白质分子结构不同的一组酶。,乳酸脱氢酶,M,骨骼型,H,心肌型,H,H,H,H,H,H,H,M,H,H,M,M,H,M,M,M,M,M,M,M,LDH,1,(H,4,),LDH,2,(H,3,M),LDH,3,(H,2,M,2,),LDH,4,(HM,3,),LDH,5,(M,4,),乳酸脱氢酶同功酶电泳,*生理及临床意义,同工酶谱的改变有助于对疾病的诊断。,心肌梗死和肝病病人血清LDH同工酶谱的变化,1,酶活性,心肌梗死酶谱,正常酶谱,肝病酶谱,2,3,4,5,血红蛋白的结构,亚基,亚基,血红蛋白,地中海贫血,：,由于,和珠蛋白肽链合成异 常而导致其比例不均衡引起的溶血性贫血。,地 区,地贫 地贫,样本数 地贫1%样本数 表型阳性数%,广州,1,681,101 6.0 13,462 452 3.36,珠海,1,028 41 3.99,9,854 227 2.30,汕头,574 38 6.6 402 21 5.2,韶关,969,40 4.13 1,597 54 3.4,湛江,1004,48 4.78 1,170 41 3.5,广东省5个城镇的和地贫的人群携带率,正常人Hb区带,：从负极向正极泳速最快的HbA，占大部分，约95%；HbA后有一较浅 区带为HbA2，正常人约2-3%,操作流程,1、薄膜准备,2、电泳仪准备,3、点样,4、上槽,5、电泳,6、染色及漂洗,注意事项,1、最好选用同一批号、厚薄均匀、质量良好的醋纤膜。,2、样品要新鲜。,3、点样要细窄、均匀、集中。,4、盐桥要平整。,5、电泳槽盖要密封。,6、室温不宜过高。,注意事项,7、选择合适的缓冲液离子强度。,8、两电泳槽内缓冲液面应在同一水平面。,9、要控制好电压、电流和电泳时间。,10、电泳槽内两极溶液要交替使用，操作时应尽量减少缓冲液的污染、水分蒸发、pH及离子强度的改变，防止霉菌的滋长。,作业,1、简述血红蛋白电泳诊断地中海贫血的原理及检验指标.,2、简述肾病综合征、慢性肝炎及肝硬化患者的血浆蛋白电泳结果可能出现怎样的改变.,