单个核细胞分离

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单个核细胞的分离,实验目的,1,熟悉免疫细胞分离的常用方法。,2,掌握外周血单个核细胞分离方法的原理、操作规程。,免疫系统,免疫器官,免疫细胞,免疫分子,外周血细胞成分,淋巴细胞,单核细胞,粒细胞,红细胞和血小板,不同细胞密度不同,人的红细胞密度为,1.093,粒细胞密度为,1.092,单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度为,1.075-1.090,血小板：,1.0301.035,细胞分离基本原理,不同细胞密度不同,不同细胞表面生物学特性不同,不同细胞表面分化抗原不同,人外周血单个核细胞（,peripheral blood mononuclear cell,，,PBMC,）包括淋巴细胞和单核细胞,是免疫学实验中常用的细胞群。,【,实验原理,】,人外周血单个核细胞,的体积、形态和比重与外周血其他细胞不同。因此利用一种介于,1.075,1.090,之间而近于等渗的聚蔗糖,-,泛影葡胺（,ficoll-hypaque,比重,1.0770.001,）混合分离液作密度梯度离心，离心后不同比重的血细胞在分离液中呈梯度分布。从而分离出,PBMC,。,Ficoll,分层液,聚蔗糖-泛影葡胺,:,商品名为,Ficoll,其密度为,1.077,0.00,1,。,主要用于分离外周血中的单个核细胞，是一种单次差速密度梯度离心的分离法。,其主要成分,:,2,份,浓度为,6,、,密度为,1.020,g/L,聚蔗糖(商品名为,Ficoll),与,1,份,浓度为,34,、,密度为,1.200,g/L,泛影葡胺水溶液混合。,用,1.0770.001,的分层液可将细胞分离,密度梯度离心,(Ficoll),离心,试剂与器材,1.标本 外周静脉血加,EDTA-K2,抗凝，或,1000U/ml,肝素抗凝血。,2.淋巴细胞分离液（聚蔗糖-泛影葡胺，比重,(1.0770.001,）有商品供应。,3.,Hanks,液,4.台盼蓝染液,5.器材 水平式离心机、显微镜、细胞计数板等。,操作方法,1.取静脉血放入抗凝管，摇匀，先作白细胞计数，然后取,1.5ml,加入等量,Hank,液，混匀。,2.取,1.5ml,Ficoll,分离液置于灭菌离心管内，用毛细吸管将稀释血液,3ml,沿管壁徐徐加入离心管，使稀释血液重叠于淋巴细胞分离液上（分层液与稀释血液体积比例为1：,2,），二者之间有一明显的界面。,3.,用水平离心机以,2000r/min,离心20,min，,离心后管内容物分为四层，上层为血浆（内含血小板），中间层为分离液，底层为红细胞和多形白细胞，在上、中层液体界面处可见到乳白色浑浊的单个核细胞层,4.用毛细吸管轻轻插到白膜层，沿试管壁周缘吸取该层单个核细胞，移入,EP,管，,2000r/min 5min,离心去血浆，,加,1mlHanks,混匀，,2000r/min,离心,5min，,弃上清液,。,5.末次离心后，吸尽上清后，将细胞悬液体积用,Hanks,还原至1,ml，,取一滴细胞悬液置血细胞计数板内计数，计算单个核细胞的回收率。,100%,单个核细胞回收率=,分离后细胞悬液,ml,每毫升单个核细胞数,全血,ml,数,全血中每毫升单个核细胞数,单个核细胞数,1,毫升细胞悬液,),4,个大方格内细胞总数,10 10,3,2(,稀释倍数,)4,6.细胞活力检测,取2滴细胞悬液与1滴台盼蓝染液混匀，加盖玻片，显微镜高倍镜观察。细胞活力百分率=蓝色细胞数,/100,个单个细胞数,结果判断,活细胞不着色，折光强，由于染料可渗入死亡细胞被染成蓝色，体积略膨大。正常情况下，活细胞应在95%以上,。,实验讨论,1,.,注意事项将稀释的血液加分层液上时，一定要细心，动作要轻，使分离液与血液的界面清楚，避免冲散分层液面或与分层液混合影响分离结果。,分离人和不同种类动物外周单个核血细胞要使用不同比重的分层液，分离人血所用分层液的比重以1.0770.00,1,为好；小鼠为1.088,而马则为1.090。,配制单个核细胞悬液所用的培养液要求等渗，有缓冲作用，并对细胞无毒性,方法评价,密度梯度离心法是一种分离单个核细胞的常用方法，,用该方法不能除去其中的单核细胞。,临床意义,分离所得的单个核细胞可满足许多实验的需要，可用于细胞的分类鉴定，及各种功能，也可用于进一步纯化淋巴细胞，分离单个核细胞技术是进行细胞免疫试验的重要技术之一。,