肠道细菌实验

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第四次实验课内容,1,、细菌代谢产物检查（示教）,2,、肠道杆菌在选择鉴别培养基的生长情况,（示教）,SS,平板、双糖铁培养基,3,、肥达试验（结果示教）,实验一 细菌代谢产物检查,细菌具有不同的代谢酶系统，因此对营养物质的利用与分解能力也各不相同，可形成不同的中间代谢产物与终末代谢产物。根据细菌的代谢能力及其产物不同鉴别细菌，称为细菌的生化反应。本实验通过介绍常用生化反应的经典试验方法，以了解细菌生化反应的机制与实验原理。,原理：,染色镜检,普通琼脂平板中菌落的形态,不能鉴别,能够鉴别,实验一 细菌代谢产物检查,细菌代谢产物,分解代谢产物,合成代谢产物,生化反应,?,细菌菌落的色素观察,金黄色葡萄球菌：产生,只局限于菌落,的,脂溶性,金黄色色素,。,铜绿假单胞菌：产生带荧光的,水溶性,色素，该色素可扩散至菌落周围，使培养基呈亮绿色。,金黄色葡萄球菌,铜绿假单胞菌,细菌菌落的溶血现象观察,乙型溶血性链球菌,:,透明的无色溶血环。,一、糖发酵试验,1.,了解糖发酵的原理和在肠道细菌鉴定中的重要作用。,2.,掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。,基本原理,糖发酵试验是最常用的生化反应，在肠道细菌的鉴定上尤为重要。绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源，但是它们在分解糖的能力上有很大的差异，有些细菌能分解某种糖并产酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和气体（如氢、甲烷、二氧化碳等）；有些细菌,只产酸不产气,。例如,大肠杆菌,能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气；,痢疾杆菌,能分解葡萄糖产酸不产气，不能分解乳糖；,乙型副伤寒杆菌,分解葡萄糖产酸产气，不能分解乳糖。,基本原理,酸的产生,可利用指示剂来断定。在配制培养基时预先加入溴甲酚紫,Ph5.2,（黄色）,-6.8,（紫色）,，当发酵产酸时，可使培养基由紫色变为黄色。,气体的产生,可由发酵管中倒置的德汉氏小管中有无气泡来证明。,糖发酵试验：,乳糖,乳酸,乳糖酶,葡萄糖发酵试验：,细 菌,葡萄糖,丙酮酸,各种酸类,甲 酸,H,2,+CO,2,脱氢酶,四、操作步骤,1,、编号,用记号笔在各试管上分别标明发酵培养基名称和所接种的菌名。,2,、接种,取盛有葡萄糖发酵培养基的试管,3,支，分别接种大肠杆菌、痢疾杆菌、乙型副伤寒杆菌。另取乳糖发酵培养基试管,3,支，分别接种这三种细菌。,3,将上述已接种的葡萄糖和乳糖发酵试管和对照管置,37,温室中培养,24,小时。,图,1,糖类发酵试验,观察结果,:,观察结果时，看各管颜色变化及杜氏小管有无气泡。,产酸产气用“”表示；,只产酸不产气用“,+”,表示；,不产酸也不产气用“,”,表示。,二、靛基质（吲哚）产生试验,(I),原理：,分解蛋白胨内的色氨酸形成靛基质（无色）,靛基质与靛基质试剂中的对二甲基氨基苯甲 醛结合而显红色,(,玫瑰吲哚,),材料：蛋白胨水培养基（氯化钠、蛋白胨、,蒸馏水）,方法：,约,0.3ml,的靛基质试剂徐徐加入细菌蛋白胨水培养物,注：加入吲哚试剂后切勿摇晃,结果：,大肠杆菌,(,),红色,痢疾杆菌,(,),黄色,乙型副伤寒杆菌,(,),黄色,红色吲哚,大肠杆菌,产气杆菌,分 解,六、硫化氢产生试验,原理：,材料：,醋酸铅培养基,（普通琼脂培养基、硫代硫酸钠溶液、醋酸铅溶液）,含硫氨基酸,硫化氢,遇铅盐或亚铁盐,黑褐色沉淀,方法：,结果：,乙型副伤寒，黑褐色,大肠埃希菌，不变色,乙型副伤寒,大肠杆菌,对蛋白质的发酵,吲哚试验,硫化氢试验,对糖的发酵,糖发酵试验,甲基红试验,VP,试验,其他,枸橼酸盐利用试验,（,21,）半固体培养基,(,动力试验,),大肠埃希菌,志贺菌 伤寒沙门菌,材料：,1,、,EMB,培养基、,SS,琼脂平板,、双糖铁培养基,2,、大肠埃希菌、伤寒沙门菌、志贺菌,选择培养基,肠道杆菌在选择鉴别培养基的生长情况,鉴别培养基,SS,培养基,（,Salmonella Shigella Agar Medium,）,SS,平板,基质,肉汤基础培养基,抑制物,胆盐、煌绿、枸橼酸钠、硫代硫酸钠,底物,乳糖,指示剂,中性红,pH,（,6.88.0,）,碱性黄色,酸性红色,菌落持点,为粉红色菌落,为无色半透明菌落,抑制作用,抑制大肠杆菌及,G,菌,用途,分离沙门菌和志贺菌属的,强,选择培养基,原理：（,SS,平板）,非致病菌,：,致病菌：,胆盐,分 解,乳糖,乳酸,胆酸,中心浑浊的粉红色菌落,不分解乳糖，菌落呈透明无色；,枸橼酸铁能指示硫化氢的产生，使菌落中心呈黑色,注意：,非致病菌并非被杀灭，故挑病原菌菌落时，尽量挑取菌落中心部分,大肠埃希菌,痢疾志贺菌,大肠埃希菌与伤寒沙门菌,双糖铁培养基,（,Double sugar Iron Medium,）,成分,含酚红指示剂的,pH7.6,的蛋白胨水,500mL,琼脂,(1.3%)6.5g,乳糖,(1%),5g,葡萄糖,(0.1%),0.5g,硫酸亚铁铵,(0.02%),0.1g,硫代硫酸钠,(0.02%)0.1g,用途,初步鉴别肠道杆菌,原理：,只分解葡萄糖：产少量酸,上层培养基的酸,+O,2,CO,2,+H,2,O,蛋白胨代谢产物,下层培养基不接触空气培养基呈酸性显黄色,葡萄糖、乳糖都分解,硫酸亚铁铵：,用以检查细菌分解蛋白质后是否产生硫化氢。,只产酸,产酸,&,产气,培养基略变碱,指示剂变红,肠道杆菌的生长结果,SS,双糖铁,大肠埃希菌 粉红色大菌落 黄色,痢疾志贺菌 无色细小 上红下黄,半透明菌落,伤寒沙门菌 无色细小 上红下黄,半透明菌落 黑色沉淀,特异性抗体（血清中）,诊断菌液,肉眼可见的凝集现象,检测试剂的成分,病人体内的反应,伤寒或副伤寒病人,O,抗原,H,抗原,含有,伤寒沙门菌,O,抗原,伤寒沙门菌,H,抗原,甲型副伤寒沙门菌,H,抗原,乙型副伤寒沙门菌,H,抗原,肥达试验,（,Widal test,）,材料,伤寒沙门菌,O,、,H,菌液，甲型副伤寒沙门菌,H,菌液和乙型副伤寒沙门菌,H,菌液。,生理盐水和患者血清（,1:20,稀释），微量反应板，,1ml,吸管，,52,水浴箱,方法,取,4,6,孔反应板,，孔横向,4,排，纵列,6,列，依次编号。,于第,2,、,3,、,4,、,5,、,6,列每孔内加入生理盐水,0.2ml,。,于第,1,、,2,列在每孔内加入稀释度为,1,：,20,的受检血清,0.2ml,，从第,2,列开始进行,倍比稀释,。,每排加入诊断菌液,0.2ml,轻轻振荡混匀后，水浴箱孵育,2,小时,ml,1,2,3,4,5,6,阴性对照,生理盐水,0.2,0.2,0.2,0.2,0.2,受检血清,0.2,0.2,0.2,0.2,0.2,稀释度,1:20,1:40,1:80,1:160,1:320,诊断菌液,0.2,0.2,0.2,0.2,0.2,0.2,血清最终稀释度,1:40,1:80,1:160,1:320,1:640,弃去,0.2ml,效价的判定,1,2,3,4,5,6,阴性对照,效价判定,H,抗原,+,+,+,+,+,1:320,O,抗原,+,+,+,+,+,1:160,PA,抗原,1:40,PB,抗原,1:40,1:40,1:80,1:160,1:320,1:640,结果观察,+,清澈透明，菌体形成凝块于管底,+,较透明，大部分菌体形成凝块于管底,+,稍浑浊，较多细小凝集,+,较浑浊，有细小凝集,浑浊，无凝集,血清凝集效价：,(,抗体滴度,),与定量,Ag,产生明显凝集（,+,）的血清最高稀释倍数,参考值,伤寒杆菌凝集价,H1,：,160,，,O1,：,80,；副伤寒凝集价,A1,：,80,，,B1,：,80,，,C1,：,80,临床意义,机体感染伤寒、副伤寒杆菌后会产生相应抗体，正常人因隐性感染或预防接种，血清中可含有一定量的抗体。一般当,H1,：,160,，,O1,：,80,，副伤寒凝集价,1,：,80,时，才有诊断意义。病程中应每周复查一次，如病人,H,与,O,的凝集价均高于参考值或较原凝集价升高,4,倍以上，则患伤寒的可能性很大。若,H,凝集价高而,O,低于正常值，则可能是以往预防接种疫苗的结果或非特异性回忆反应所致。,O,抗原 沙门菌属间有交叉反应,IgM,H,抗原 种特异性,-,伤寒沙门菌,IgG,甲型副伤寒沙门菌,乙型副伤寒沙门菌,结果分析,O,与,H,抗体的诊断意义,O,抗体：,IgM,H,抗体：,IgG,O,抗体,H,抗体,诊断,肠热症,感染早期或与伤寒沙门菌,O,抗原有交叉反应的其他沙门菌感染,预防接种或非特异性回忆反应,患病可能性小,一般认为,O,抗体效价在,1,：,80,以上，,H,抗体效价在,1,：,160,以上，有辅助诊断意义。但在分析结果时，应注意以下两点：,（,1,）非肠热症患者，由于曾接种过伤寒，副伤寒疫苗或以往在流行区有过隐性感染或患过伤寒，副伤寒，以及回忆反应等原因，也可呈现阳性结果。不过，由这些原因所引起的阳性反应主要是,H,抗体升高，,O,抗体效价一般不高，同时，每隔,57,天试血一次，其抗体效价一般不会随病程而升高。上述这些都有别于现症感染。,（,2,）少数肠热症患者，由于发病初期曾使用大量抗生素，或机体有免疫缺陷病，或机机反应性极弱等原因，抗体效价可以很低，甚至为阴性结果。,因此不能只根据肥达氏试验的结果去作简单肯定或否定的结论，必须结合当地流行情况，既往接触史，以及临床症状和体征，作出正确的判断。,谢谢大家！,