基因工程及应用课件

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,基因工程及应用,溧阳市埭头中学,孙定川,基因工程及应用溧阳市埭头中学孙定川,1,随着社会的发展，人们的需求越来越趋于多样化，人们希望按照自己的意图改变物种的基因，以期获得新的性状、得到新的生物产品。经典遗传学主要通过自然选育来挑选已发生自发突变的新变种；通过用物化因子（如辐射、药物处理等）来进行人工诱变，得到所需的性状；通过细胞杂交使得某种突变性状得以显现，从而寻找新类型。但所有这些，都具有相当大的偶然性，效率不高，难以真正看到基因。由于经典遗传学所研究的基因不能离开染色体而独立进行复制，所以基因拷贝数的增加是有限的；由于染色体减数分裂受同源性的支配，远缘杂交难以实现。人们强烈希望新的育种方式出现。在疾病防治方面，有许多严重威胁人类健康的病症，如遗传性疾病、心血管病、恶性肿瘤、免疫系统疾病等，病因还不太清楚。解决这些问题，必需依赖于生命科技甚至整个科学技术的革命.,在上世纪中下叶，科学进步的机遇终于到来，这就是分子生物学理论的创立和突破性进展，特别是基因工程（遗传工程）-DNA体外重组技术的出现。,随着社会的发展，人们的需求越来越趋于多样化，人们希望按照自,2,生物之所以体现出各种形态是基因表达的结果，各种生物间的性状千差万别这是为什么呢？,问题：,例：,1,青霉菌能产生对人类有用的抗生素,青霉素。,2,豆科植物的根瘤菌能够固定空气中的氮气。,3,人的胰岛B细胞能分泌胰岛素调节血糖的浓度。,小结,：这些性状都是基因特异性表达的结果,人类能不能改造基因呢？能不能使本身没有某个性状的生物具有某个特定性状呢？,问题：,生物之所以体现出各种形态是基因表达的结果，各种生物间的性状千,3,标准概念,：,在,生物体外,，通过对,DNA分子,进行人工“切割”和,“拼接”，对生物的,基因,进行改造和重新组合，然后导入受体细胞,内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出,人类所,需要的基因产物,。,因此，基因工程又叫做,基因拼接技术,或,DNA重组技术,一、基因工程的概念,通俗概念：,按照人们的意愿，把一种生物的个别基因复制出来,加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，,定向地改造,生物,的遗传性状。,标准概念：在生物体外，通过对DNA分子进行人工“切割”和一、,4,基因工程的别名,操作环境,操作对象,操作水平,基本过程,结果,基因拼接技术或DNA重组技术,生物体外,基因,DNA,分子水平,剪切 拼接 导入 表达,人类需要的基因产物,基因工程的别名操作环境操作对象操作水平基本过程结果基因拼接技,5,一、基因工程的基本内容,基因工程，兴起于20世纪70年代。人类实现对基因进行自如地操作、转移和改造的理想，是在核酸限制性内切酶、载体质粒、连接酶和其它修饰酶被陆续发现以后。在此基础上，核酸和蛋白质序列测定、基因体外快速突变、DNA的人工合成等，则使得基因工程逐渐成熟和发展。,通过对基因工程概念的理解，我们知道其操作水平是在DNA分子水平，用普通的操作工具能够在如此微观的条件下操作吗？,问题：,一、基因工程的基本内容通过对基因工程概念的理解，我们知道其操,6,基因操作的工具,苏云金芽孢杆菌（有抗虫特性）,抗虫基因,普通棉花（无抗虫特性）,棉花细胞（含抗虫基因）,导入,与运载体DNA拼接,棉花植株（有抗虫特性）,关键步骤一：,抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取,关键步骤二：,抗虫基因与运载体DNA连接,关键步骤三：,抗虫基因进入棉细胞,关键步骤一的工具：,基因的剪刀限制性内切酶,关键步骤二的工具：,基因的针线DNA连接酶,关键步骤三的工具：,基因的运输工具运载体,思考：关键步骤是什么？（难题）,基因操作的工具苏云金芽孢杆菌（有抗虫特性）抗虫基因普通棉花（,7,分布：,作用特点：,结果：举例：,主要在微生物中,。,特异性。,一种限制酶只能识别一种特定核苷酸序列，在特定的切点上切割DNA分子。,产生黏性未端（碱基互补配对）。,大肠杆菌的一种限制酶能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。,思考题：要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶,切几个切口,？可产生,几个,黏性未端？,（,1,）基因的剪刀,限制性内切酶（简称,限制酶,）,限制酶切割DNA分子示意图,分布：主要在微生物中。特异性。一种限制酶只能识别一种特定核,8,DNA连接酶的连接作用示意图,被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有,几个伸出的核苷酸,，它们之间,正好互补配对,，这样的切口叫做,黏性未端,。可以设想，如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，然后让两者的黏性未端黏合起来，似乎就可以合成,重组的DNA分子,了。但是，实际上仅仅这样做是不够的，,互补的碱基处虽然连接起来,，但是这种连接只相当于把断成两截的梯子中间的,氢键,（,踏板,）,连接起来，,两边的扶手的断口处,还没有连接起来。要把,磷酸二酯键,（,扶手,）,的断口处连接起来，也就是把,两条DNA未端之间的缝隙“缝合”,起来，还要靠另一种极其重要的工具,DNA连接酶,。,（,2,）基因的针线,DNA,连接酶（,图示,）,DNA连接酶的连接作用示意图被限制酶切开的DNA两条单链的切,9,DNA连接酶的连接作用示意图,连接的部位：,结果：思考题：,磷酸二酯键（梯子的扶手），不是氢键（梯子的踏板）。,两个相同的黏性未端的连接。,用DNA连接酶连接两个相同的黏性未端要连接几个磷酸二酯键？用限制酶切一个特定基因要切断几个磷酸二酯键？,（,2,）基因的针线,DNA,连接酶（,图示,）,DNA连接酶的连接作用示意图 连接的部位：磷酸二酯,10,（,3,）基因的运输工具,运载体（,图示,）,作用：,具备的条件：,种类：,将外源基因送入受体细胞。,能在宿主细胞内复制并稳定地保存。,具有多个限制酶切点。,具有某些标记基因。,质粒、噬菌体和动植物病毒。,（3）基因的运输工具运载体（图示）作用：具备的条件,11,大肠杆菌质粒的分子结构示意图,质粒能够“友好”地“借居”在宿主细胞中。一般来说，,质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性的作用,，但是，,质粒的复制则只能在宿主细胞内完成。,质粒是基因工程最常用的,运载体,，它存在于许多,细菌,以及,酵母菌,等生物中，是,细胞染色体外,能够,自主复制的很小的环状DNA分子,，最常用的质粒是,大肠杆菌的质粒,。大肠杆菌的质粒中常含有抗药基因，如抗四环素的标记基因。细菌质粒的大小只有普通细菌染色体DNA的百分之一左右。,质粒,大肠杆菌质粒的分子结构示意图质粒能够“友好”地“借居”在宿主,12,存在于许多细菌及酵母菌等生物中。,质粒的存在对宿主细胞无影响。,质粒的复制只能在宿主细胞内完成。,细胞染色体外能自主主复制的小型环状,DNA,分子。,思考题：,1、,质粒上会存在某些标记基因，这些标记基因有什么用途？,质粒的特点：,存在于许多细菌及酵母菌等生物中。质粒的存在对宿主细胞无影响,13,基因操作的基本步骤示意图,基因操作的基本步骤示意图,14,三、基因操作的基本步骤（,图示,）,问题：,举例说明什么是目的基因？获得目的基因的途径如何？从供体细胞DNA中直接分离基因的最常用的方法叫什么？简要说出该方法的过程是什么？人工合成基因的方法有几种？其操作过程分别是什么？,三、基因操作的基本步骤（图示）问题：举例说明什么是目的基因,15,从供体细胞的DNA中,直接分离基因,方法：鸟枪法,（1）鸟枪法的过程：,（一）提取目的基因的途径,反转录法,（2）反转录法的过程：,根据已知氨基酸序列,合成DNA,人工合成基因（真核细胞）,运载体,供体细胞中DNA,许多DNA片段,限制酶,载入,导入,受体细胞,产生特定性状,目的基因,分离,外源DNA,扩增,目的基因的mRNA,单链DNA,反转录,双链DNA（即目的基因）,合成,从供体细胞的DNA中（一）提取目的基因的途径反转录法根据已知,16,（3）根据已知氨基酸序列合成DNA的过程,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,目的基因,推测,化学合成,推测,（3）根据已知氨基酸序列合成DNA的过程蛋白质的氨基酸序列m,17,DNA合成仪,另一条途径是,根据已知的蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列,，然后,按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列,，,再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因,。如人的血红蛋白基因，胰岛素基因等就可以通过人工合成基因的方法获得。,目前人工合成基因的方法主要有两条途径。一条途径是,以目的基因转录成的信使RNA为模板,，,反转录成互补的单链DNA,，然后,在酶的作用下合成双链DNA,，,从而获得所需要的基因。,DNA合成仪另一条途径是根据已知的蛋白质的氨基酸序列，推测出,18,目的基因是指人们所需要的特定基因，有两条途径。,鸟枪法,，其过程是：,此法的,优点,：操作简便,缺点,：工作量大，专一性较差，分离出来的有时,并非一个基因，具有一定的盲目性。,人工合成基因法,1,反转录法：目的基因 mRNA 单链DNA,双链DNA,转录,逆转录,互补合成,供体细胞中的DNA DNA片段 重组DNA,不同受体细胞 DNA扩增 目的基因的,细胞 分离目的基因,限制酶,运载体,找出,2根据已知的氨基酸序列合成DNA：由蛋白质中的氨基酸序列,mRNA中碱基序列 DNA碱基序列 目的基因,推出,推测出,化学合成,小结：,目的基因是指人们所需要的特定基因，有两条途径。鸟枪法，其,19,2、,目的基因与运载体结合,步骤,：,（1）用一定的限制酶切割质粒，使其出现2个有粘性末端的切口。,（2）用同种限制酶切断目的基因，产生相同的粘性末端。,（3）将切下的目的基因片段，插入到质粒的切口处，再加入适量的DNA连接酶，使质粒与目的基因结合成重组质粒,思考题,：目的基因与运载体结合的结果可能有几种情况？,（有三种情况：目的基因与目的基因结合，质粒与质粒结合，目的基因与质粒结合。,）,3、,将目的基因导入受体细胞,导入方法,：借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。,导入过程,：（运载体为质粒，受体细胞为细菌，一般是将细菌用,CaCl2处理，以增大细菌细胞壁的通透性，使含有目的,基因的重组质粒进入受体细胞）,2、目的基因与运载体结合步骤：思考题：目的基因与运载体结合,20,4、,目的基因的检测和表达,检测,：方法很多，通过检测运载体的标记基因的有无，来判断目的基因是否导入,表达,：通过特定性状的产生与否来确定目的基因是否表达。,问题,：1、如何检测受体细胞是否真正导入了重组DNA分子？,2、如何来确定目的基因是否得以表达？,例如,：大肠杆菌的某种质粒具有青霉素抗性基因，当这种质粒与,外源DNA组合在一起形成重组质粒，并被转入受体细胞以后，就,可以根据受体细胞是否具有青霉素抗性来判断受体细胞是否获得,了目的基因。,例如,：科学家最初做抗虫棉实验时，已经检测出棉的植株中含有,抗虫基因，但却无抗虫效果，这说明了什么？科学家在研究的基,础上对棉植株中的抗虫基因进行了修饰，结果很快出现了抗虫性,状，这说明了什么？,4、目的基因的检测和表达 检测：方法很多，通过检测运载体的标,21,总结：,基因操作的基本步骤：,细菌,取出质粒,用相同的限制酶切出粘性末端,供体细胞,取出DNA分子,用限制酶切取目的基因,将目的基因插入质粒切口,用连接酶将目的基因与质粒相连,将重组DNA分子导入受体细胞,重组D