荧光化学发光在植物分子生物学的应用课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,荧光化学发光在植物分子生物学的应用,*,PPT,文档演模板,Office,PPT,荧光化学发光在植物分子生物学的应用,2024/11/15,荧光化学发光在植物分子生物学的应用,荧光化学发光在植物分子生物学的应用2023/10/9荧光化学,1,Outline,1、荧光技术,2、化学发光技术,荧光化学发光在植物分子生物学的应用,Outline1、荧光技术荧光化学发光在植物分子生物学的应用,2,1、荧光技术,荧光化学发光在植物分子生物学的应用,1、荧光技术荧光化学发光在植物分子生物学的应用,3,荧光技术的分类,荧光强度,时间分辨荧光,荧光偏振,荧光共振能量传递,均相时间分辨荧光,荧光化学发光在植物分子生物学的应用,荧光技术的分类荧光强度荧光化学发光在植物分子生物学的应用,4,1）荧光强度（FI）,S,1,inner orbital,outer orbital,nucleous,Excitation Signal,Ex,Em,S,o,Emission Signal,荧光化学发光在植物分子生物学的应用,1）荧光强度（FI）S1inner orbitalouter,5,FI应用的优势,灵敏度高，,使用方便、安全,可以灵活地利用,各种类型的荧光探针和荧光染料,对目标物质进行特异性标记，大大减少杂质的信号干扰,可以进行活细胞或活体检测（细胞毒性小）,可以进行多重专一性标记（如蓝色细胞核/红色线粒体）,荧光化学发光在植物分子生物学的应用,FI应用的优势荧光化学发光在植物分子生物学的应用,6,FI应用范围,生物大分子的定量分析,核酸、蛋白质,酶活性分析,糖甘酶、蛋白酶、脱氢酶、过氧化物酶,钙流检测,报告基因检测（GFP）,荧光化学发光在植物分子生物学的应用,FI应用范围生物大分子的定量分析荧光化学发光在植物分子生物学,7,FI应用核酸定量分析,Picogreen荧光染料,可以排除蛋白质等的信号干扰（用于检测蛋白质样品中的微量核酸）,Arabidopsis Chromatin DNA,The Plant Cell,18461858,2003(15),Tobacco RNA,The Plant Cell,22032217,2003(15),荧光化学发光在植物分子生物学的应用,FI应用核酸定量分析Picogreen荧光染料Arabid,8,FI应用糖苷酶活性分析,b,-D-glucosidase 4-MU,b,-D-glucopyranoside,b,-D-fucosidase 4-MU,b,-D-fucoside,Decreased Glucosidase and Fucosidase Activity in,nai1-1,and,nai1-2 Arabidopsis,Mutants.(Plant Cell,15361549,2004-16),荧光化学发光在植物分子生物学的应用,FI应用糖苷酶活性分析b-D-glucosidase,9,FI应用蛋白酶活性分析,Fractionation of Soybean Proteases after Oxidative Stress.(H,2,O,2,treated vs.control)(Plant Cell,431443,1999-11),Arginine-specific Protease Z-Gly-Gly-Arg-AMC,荧光化学发光在植物分子生物学的应用,FI应用蛋白酶活性分析Fractionation of S,10,FI,应用的局限性,背景荧光干扰,微孔板的自发荧光,细胞的内源荧光,荧光化学发光在植物分子生物学的应用,FI应用的局限性背景荧光干扰荧光化学发光在植物分子生物学的应,11,2）时间分辨荧光（TRF）,Elapsed Time,Intensity,Excitation,AutoFluorescence,Fluorescein Emission,Europium Emission,Long Decay Time.,-Measurement-,利用时间特性达到超高灵敏度,荧光化学发光在植物分子生物学的应用,2）时间分辨荧光（TRF）Elapsed TimeInten,12,Europium,ion,镧系元素,镧系元素螯合物,时间分辨荧光素镧系元素螯合物,荧光化学发光在植物分子生物学的应用,Europium镧系元素镧系元素螯合物时间分辨荧光素镧系元,13,孵育(结合),洗涤（去除非结合）,检测,缺点：需洗涤；洗涤强度很难一致，结果重复性差。,FI/TRF应用的局限性（非均相技术）,荧光化学发光在植物分子生物学的应用,孵育(结合)缺点：需洗涤；洗涤强度很难一致，结果重复性差。F,14,荧光偏振（FP）,荧光共振能量转移（FRET）,均相时间分辨荧光（HTRF）,均相技术的优势,孵育(结合),检测,优点：无需洗涤；均一性、重复性好,“Add,Mix,and Read”,荧光化学发光在植物分子生物学的应用,荧光偏振（FP）均相技术的优势优点：无需洗涤；均一性、重复,15,3）荧光偏振（FP）,Polarizer,Analyzer,偏振光,荧光化学发光在植物分子生物学的应用,3）荧光偏振（FP）PolarizerAnalyzer偏振光,16,荧光分子运动,荧光分子静止,100%,0%,荧光偏振（FP）原理,0%,荧光偏振是一种测量分子旋转速率的技术,。,P =,I,|,+I,|_,I,|,I,|_,荧光化学发光在植物分子生物学的应用,荧光分子运动荧光分子静止100%0%荧光偏振（FP）原理,17,标记的配体(低偏振值）,目标分子,与标记的配体结合,（高偏振值）,FP应用方式偏振值与分子大小的关系,荧光化学发光在植物分子生物学的应用,目标分子FP应用方式偏振值与分子大小的关系荧光化学发光在植,18,FP应用的优势,均相(无分离/洗涤），在溶液中测量；可以实时检测（动力学检测）；快速，容易实现高通量,测量的是比值，结果与荧光基团的绝对浓度无关,荧光化学发光在植物分子生物学的应用,FP应用的优势均相(无分离/洗涤），在溶液中测量；可以实,19,FP应用范围,受体配体相互作用,多肽蛋白质结合,蛋白质核酸结合,酶活性分析,淀粉酶、蛋白酶、磷酸激酶、磷酸酶,荧光化学发光在植物分子生物学的应用,FP应用范围受体配体相互作用荧光化学发光在植物分子生物学的,20,fragments,Amylase,Amylose,FP应用淀粉酶活性分析,荧光标记的Amylose被分解成小片段(偏振值下降),淀粉酶会促进生物体内淀粉粒的降解，进而产生更多的能量物质，来响应某些环境刺激或促进种子萌发。,荧光化学发光在植物分子生物学的应用,fragmentsAmylaseAmyloseFP应用淀粉,21,FP,应用的,局限性,使用具有较短寿命的荧光素（如Fluorescein）,依赖于分子结合造成的分子体积的显著改变,LARGE molecule,荧光化学发光在植物分子生物学的应用,FP应用的局限性使用具有较短寿命的荧光素（如Fluoresc,22,4）荧光共振能量传递（FRET）,Binding,NO Binding,荧光化学发光在植物分子生物学的应用,4）荧光共振能量传递（FRET）Binding NO,23,均相检测（无分离和洗涤步骤）,实时连续地观察活细胞的动态变化,FRET,应用的,优势,荧光化学发光在植物分子生物学的应用,均相检测（无分离和洗涤步骤）FRET应用的优势荧光化学发光在,24,FRET应用范围,酶活性分析,蛋白酶、磷酸激酶,蛋白质核酸相互作用,酵母双杂交系统、噬菌体展示系统所筛选克隆的复证,钙流检测、离子通道研究,蛋白质的结构研究,荧光化学发光在植物分子生物学的应用,FRET应用范围酶活性分析荧光化学发光在植物分子生物学的应用,25,FRET应用钙流检测,以荧光蛋白为基础的Ca,2+,sensor,供体：CFP,受体：YFP,荧光化学发光在植物分子生物学的应用,FRET应用钙流检测以荧光蛋白为基础的Ca2+senso,26,Guard cell（Arabidopsis）胞浆钙离子动态,(Plant J,1999-19,p735-747),FRET应用示例钙流检测,荧光化学发光在植物分子生物学的应用,Guard cell（Arabidopsis）,27,FRET应用胞内激酶活性分析,Indicators for protein phosphorylation in living cells,已知蛋白激酶特异性的底物结构域,磷酸化识别结构域,蛋白质磷酸化是信号转导过程中的重要标志,荧光化学发光在植物分子生物学的应用,FRET应用胞内激酶活性分析Indicators for,28,FRET,应用的,局限性,信噪比经常不佳，通常为1：1,-背景主要来自受体被直接激发的信号,荧光化学发光在植物分子生物学的应用,FRET应用的局限性荧光化学发光在植物分子生物学的应用,29,供体：镧系元素螯合物,受体：XL665,5）均相时间分辨荧光（HTRF）,荧光化学发光在植物分子生物学的应用,5）均相时间分辨荧光（HTRF）荧光化学发光在植物分子生物学,30,P,APC,Excitation,at 320nm,Emission,at 665nm,Time,Intensity,HTRF,应用,的优势灵敏度更高的FRET,P,Y,energy transfer,APC,Eu,Excitation,at 320nm,Emission,at 665nm,Time,Intensity,荧光化学发光在植物分子生物学的应用,PAPCExcitationEmissionTimeInte,31,2、化学发光技术,荧光化学发光在植物分子生物学的应用,2、化学发光技术荧光化学发光在植物分子生物学的应用,32,化学发光技术的分类,发光,发光共振能量传递,荧光化学发光在植物分子生物学的应用,化学发光技术的分类发光荧光化学发光在植物分子生物学的应用,33,1）发光（Lum）,Substrate,Product+,Light,Enzyme,优势：超高灵敏度,荧光化学发光在植物分子生物学的应用,1）发光（Lum）SubstrateProduct+Lig,34,Lum应用范围,钙流检测,基因调控,ATP检测,发光免疫分析,荧光化学发光在植物分子生物学的应用,Lum应用范围钙流检测荧光化学发光在植物分子生物学的应用,35,发光应用钙流检测,水母发光蛋白Aequorin,Ca,+,荧光化学发光在植物分子生物学的应用,发光应用钙流检测 水母发光蛋,36,Kinetics of the-glucan（葡聚糖）elicitor-induced enhancement of the,Ca,2+,cyt in soybean cells,.,（Biological Procedures Online 2002-4/1,p105-118）,发光应用示例钙流检测,荧光化学发光在植物分子生物学的应用,Kinetics of the-glucan（葡聚糖）e,37,发光应用基因调控,pSP-luc,+,(转化拟南芥细胞),荧光化学发光在植物分子生物学的应用,发光应用基因调控pSP-luc+(转化拟南芥细胞)荧光,38,Cultured cells show diurnal rhythms(Arabidopsis),(Plant Cell Physiol,2004-45/1,p57-67),CCA1的启动子区域,CCA1在昼夜节律调节起中心作用的转录因子,发光应用示例基因调控,荧光化学发光在植物分子生物学的应用,Cultured cells show diurnal rh,39,2）发光共振能量传递（BRET）,Donor=Renilla luciferase(Rluc),Acceptor=YFP,荧光化学发光在植物分子生物学的应用,2）发光共振能量传递（BRET）荧光化学发光在植物分子生物