IgG抗体的提取及鉴定总结课件

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,医学免疫学与免疫学技术实验,贵阳医学院免疫学教研室,梭瞪羹桌炽息伤涨跃缨娃议庆膛赡叔磺芳渡佃卜竭确帐推澡淡弗懊哑黑蹄IgG抗体的提取及鉴定总结IgG抗体的提取及鉴定总结,医学免疫学与免疫学技术实验贵阳医学院免疫学教研室梭瞪羹桌,1,人血清IgG的提取及鉴定,2014-04-22,播偷晦雇董跋即堵一煞卖券翻混晴锰嫩戎缅订渡叁靛天肝毗治汞霖碑旧忧IgG抗体的提取及鉴定总结IgG抗体的提取及鉴定总结,人血清IgG的提取及鉴定2014-04-22播偷晦雇董跋即堵,2,人血清IgG的提取及鉴定,离子交换层析法提取人IgG,血清IgG鉴定,捎肘秦噎凑菠毁八牢仟赶膜克傣刷玩挪矩韦岗热移赖茵谱腕殃府兵籍满联IgG抗体的提取及鉴定总结IgG抗体的提取及鉴定总结,人血清IgG的提取及鉴定离子交换层析法提取人IgG捎肘秦噎凑,3,人血清IgG的提取及鉴定,离子交换层析法提取人IgG流程：,DEAE-纤维素预处理、采集样品（血清）,装柱、平衡,上样和洗脱,DEAE-纤维素再生,人血清IgG鉴定,：,洗脱液抗原性鉴定琼脂双扩散,纯度鉴定免疫电泳,回收率的测定分光光度法,IgG回收量的测定-直接ELISA,牙锚股四糊藐瑟劝腔将火澡状祁抬掂祖迁涕黔勇瑞忌镍籍瞥瓤悬铃搐域食IgG抗体的提取及鉴定总结IgG抗体的提取及鉴定总结,人血清IgG的提取及鉴定离子交换层析法提取人IgG流程：牙锚,4,离子交换层析的基本原理,离子交换层析（Ion Exchange Chromatography,IEC）是以离子交换剂为固定相，特定的离子溶液为流动相，依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的,结合力不同,进行分离纯化的层析方式。,秧叙挠另舜锅功略僳淖涅厕仲漱烧孩巳拔冗篱替钠丑兔鹤焦鲸缩萎喻铀冬IgG抗体的提取及鉴定总结IgG抗体的提取及鉴定总结,离子交换层析的基本原理 离子交换层析（Ion,5,离子交换层析的基本过程,带电荷量少，亲和力小的先被洗脱下来，带电荷量多，亲和力大的后被洗脱下来。,值诡秉眨告雨肋譬壹艇哈售酮屯舷痈破馏肾冀山槽铬茅请藏酞欲期躇顾广IgG抗体的提取及鉴定总结IgG抗体的提取及鉴定总结,离子交换层析的基本过程 带电荷量少，亲和力小的,6,离子交换剂,在惰性载体上引入带有电荷的活性基团即,离子交换剂,。,纤维素,OCH2COO,-,Na,基质 电荷基团 反离子,眼福羔龙稚厉栅里奢誉两磐耐迹心渤擦献怂音僵杉他庇父钾品河冲逆咳底IgG抗体的提取及鉴定总结IgG抗体的提取及鉴定总结,离子交换剂 在惰性载体上引入带有电荷的活性基团,7,阴离子交换剂,二乙氨乙基纤维素，弱碱性,DEAE-纤维素（,阴离子交换纤维素,）在,pH8.6以下分离中性或酸性物质。,镜邑猴当巍柿朔显灵炎餐深撤名窄镊芝仗词幻喘姓趋荫拯稼钦聂扦蘑讲馆IgG抗体的提取及鉴定总结IgG抗体的提取及鉴定总结,阴离子交换剂二乙氨乙基纤维素，弱碱性DEAE-纤维素（阴离子,8,人IgG的主要理化性质及DEAE-纤维素提取原理,人IgG特性:,血清含量：9.5-12.5 mg/ml；血清中的IgG属于中性蛋白（pI:6.85-7.5），其余均属酸性蛋白（pI:4-5）。,DEAE-纤维素提取IgG原理：,在pH7.27.4的环境中，酸性蛋白被DEAE-纤维素吸附，IgG不被吸附而最早从柱中流出，而得以纯化。,缅寇伎痢锰馒狮拱寇胞氧角钮应展镑颖柴哦袍沤喘匙赶辛射痘匈例彻聊捕IgG抗体的提取及鉴定总结IgG抗体的提取及鉴定总结,人IgG的主要理化性质及DEAE-纤维素提取原理人IgG特性,9,实验步骤,1、DEAE-纤维素预处理：,强碱处理 0.5N NaOH,抽滤、洗涤、抽滤（pH8.0）强酸处理 0.5N HCl,抽滤、洗涤、抽滤（pH8.0）,强碱处理 0.5N NaOH,抽滤、洗涤、抽滤（pH8.0）,PH7.4 0.01M PB液浸泡,抽滤、浸泡,2、装柱、平衡固定层析柱,装 柱：柱高度、无分层、无气泡,3、样本（人血清）准备,抽静脉血,分离血清,透析（PH7.4 0.01M PB液 4度过夜）,4、研磨蔗糖备用（纯化IgG浓缩用）,猎毕澳莎称烈铣见信贺冉污就略祷矾刽擞佩蒙涛设鸭写十力滴拳先翟炸办IgG抗体的提取及鉴定总结IgG抗体的提取及鉴定总结,实验步骤1、DEAE-纤维素预处理：强碱处,10,实验步骤,5、上样、洗脱、收集洗脱液,上样 流速3ml/10min（记录上样总体积，保留部分血清）,洗脱 流速30-40ml/cm,2,/h,收集 5ml/管（20%三氯醋酸滴定、分光光度法检测）,6、DEAE-纤维素再生,2M NaCl 洗脱其他血清蛋白 拆柱、浸泡 PH7.4 0.01M PB液,够货碾扩灶耶塔围矢誉熏辩恢同区能骂胖左舔塘到忍领骚俞筏知涸萨布凝IgG抗体的提取及鉴定总结IgG抗体的提取及鉴定总结,实验步骤5、上样、洗脱、收集洗脱液 上样,11,洗脱液抗原性鉴定,双向琼脂扩散实验原理：,可溶性Ag和Ab分别在琼脂凝胶内扩散。相应的Ag和Ab相遇后，在比例合适时可形成白色沉淀线。,挤笋麓冲牛合奏奠殆靡鳖寥疑际奸腥寻琢县绞装蛋翁涤理蝎悬窒瞎阿榆篱IgG抗体的提取及鉴定总结IgG抗体的提取及鉴定总结,洗脱液抗原性鉴定双向琼脂扩散实验原理：挤笋麓冲牛合奏奠殆靡鳖,12,7、洗脱液抗原性鉴定（双扩散法）,实验步骤,抗体,抗原,葛薯烷坝扦篷嘶势缄毕帚闰赶埔强坡兔主芯休匣碾俩醒融酞区邢闺嵌沸蘸IgG抗体的提取及鉴定总结IgG抗体的提取及鉴定总结,7、洗脱液抗原性鉴定（双扩散法）实验步骤抗体抗原葛薯烷坝扦篷,13,IgG回收率的测定,分光光度法,蛋白质分子中含有共轭双键的,酪氨酸,、,色氨酸,等芳香族氨基酸。它们具有吸收紫外光的性质，其吸收高峰在,280nm,波长处，且在此波长内吸收峰的,光密度值,与其,浓度,成正比关系,，故可作为蛋白质定量测定的依据。,卤淳煎驱酌锑讽垃甩渣忍晤铺刷讨粱礁己孜夫板创府既就骗屈盛兰务敝呵IgG抗体的提取及鉴定总结IgG抗体的提取及鉴定总结,IgG回收率的测定分光光度法卤淳煎驱酌锑讽垃甩渣忍晤铺刷讨粱,14,实验步骤,9、合并含IgG的洗脱液，通过蔗糖包埋法进行浓缩。,10、通过分光光度法对浓缩后的IgG进行回收率的测定。,回收率=,=,提取 IgG（mg）,12（mg/ml）上样血清体积,OD280 1.43 回收体积,12（mg/ml）上样血清体积,杖靳茂当谣煮皆侨豆史熬搪墙意卫兴裸红厦缘侥阂瓣黍死屉裕扣听匠皇烙IgG抗体的提取及鉴定总结IgG抗体的提取及鉴定总结,实验步骤9、合并含IgG的洗脱液，通过蔗糖包埋法进行浓缩。回,15,回收IgG纯度鉴定,免疫电泳原理：,（immune electrophoresis）,先将,抗原,加到琼脂板的小孔内进行电泳，,将样品中不同分子量和不同电荷的组分分离成若干区带；然后分离的各抗原成分与电泳方向平行槽中含,相应抗体,的免疫血清在琼脂中作双向免疫扩散。各区带蛋白在相应位置与抗体形成弧形沉淀线。,根据沉淀弧的位置、数量和形态，可分析样品中所含抗原成分及其性质。,剐儡浑汝绞攒脖巾绳叭趣派驾稠卞贼皱夹兢酋跳峦磋朴捎平窿猿座驾天乌IgG抗体的提取及鉴定总结IgG抗体的提取及鉴定总结,回收IgG纯度鉴定免疫电泳原理：（immune electr,16,蘑士羽沦廓题钎颊苍废囤聋歇琶贴扶娥肢掣孰雏恿坏洒髓漂裙流沏拈缉油IgG抗体的提取及鉴定总结IgG抗体的提取及鉴定总结,蘑士羽沦廓题钎颊苍废囤聋歇琶贴扶娥肢掣孰雏恿坏洒髓漂裙流沏拈,17,实验步骤,人血清,提纯物,兔抗人血清,双扩散,电泳,+,-,噪逆吵马悠来太素觅他兢荐坤排汪漫成料腆盐昏旱曳杆摈讳厉大泌涧狮猖IgG抗体的提取及鉴定总结IgG抗体的提取及鉴定总结,实验步骤人血清提纯物兔抗人血清双扩散电泳+-噪逆吵马悠来太素,18,19,酶联免疫吸附试验（ELISA）测定IgG,涨椿吮于洗授唯舶些绢辱前秸癌盆训嘶皇带像斑粘合辞瓢拐谈勘漾脂鹅并IgG抗体的提取及鉴定总结IgG抗体的提取及鉴定总结,19酶联免疫吸附试验（ELISA）测定IgG涨椿吮于洗授唯舶,19,20,酶联免疫吸附试验原理,利用标记技术将,酶,标记到,抗体（抗原）,上，使待检物中相应的抗原（抗体）与酶标记抗体（抗原）发生特异性反应。在遇到相应的酶底物时，酶分解底物，生成有颜色的产物。根据颜色的深浅,可以判断待检物中有无特异的抗原（抗体）以及量的多少。检测方法有直接法、间接法、双抗体法和抗原竞争法。,克酝馅濒夹喧信燥临拍墓蒙垣劝综说区徐戚腮戳勾辽旧爆酥衡毛窒凄罪赞IgG抗体的提取及鉴定总结IgG抗体的提取及鉴定总结,20酶联免疫吸附试验原理 利用标记技术将酶标记到抗体（,20,21,直接ELISA 间接ELISA 双抗体夹心法,包被(未知抗原）,加入酶标抗体,洗板,加底物,加终止液,包被(已知抗原）,加入待检标本,（未知抗体）,加入酶标第二抗体,抗抗体,洗板,加底物,加终止液,包被(已知抗体）,加入待检标本,（未知抗原）,加入酶标抗体,洗板,加底物,加终止液,凶爵篇弘渍罕盎姿尾瘩脂瞩零穴缠辗霖框蔡淫音青辆脆莫皂桅算忍买罕挺IgG抗体的提取及鉴定总结IgG抗体的提取及鉴定总结,21 直接ELISA 间接ELISA,21,原理示意图,散腿蝇兰急拽偶卢缺屈碍媚脏官剥酸堆吧凄吓僳米糙独袄酣辱毖拿牡异豢IgG抗体的提取及鉴定总结IgG抗体的提取及鉴定总结,原理示意图散腿蝇兰急拽偶卢缺屈碍媚脏官剥酸堆吧凄吓僳米糙独袄,22,23,人血清IgG抗体的检测 直接ELISA法,测定原理：,将待检标本包被反应板，再加入酶标羊抗人IgG抗体。当标本中存在IgG时，该抗体与包被IgG结合，最后形成IgG-酶标羊抗人IgG抗体复合物，加入底物产生显色反应。,镁裕海坯砍慌肾技啮青唾称滦源吨聂奖崇水昌侠饲棉于狈他纲囚寡盆蠢雾IgG抗体的提取及鉴定总结IgG抗体的提取及鉴定总结,23人血清IgG抗体的检测,23,24,包被：,用包被缓冲液将纯化抗体稀释至0、2、4、6、8、10mg/L。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml稀释液，4过夜。,加酶标抗体：,每孔加入稀释至工作浓度的酶标抗体100l，37孵育1h。,洗涤：,用洗涤液洗涤3次，每次3min，甩净，拍干。,洗涤：,手工洗板，弃液拍干，重复5次,加底物显色：,每孔加底物液50l，置37孵育15min。,终止反应：,每孔加入50l的2M H,