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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,Gene detection,cloning and transformation,目的基因,可克隆的,优良性状的相关基因,主要是结构基因,DNA,克隆,DNA cloning,Subcloning,Host and vector,DNA libraries,Screening libraries,Analysis of clones,Application of clone,结构基因组成,转录启动子、基因编码区、转录终止子。,启动子：,DNA,上,RNA,聚合酶识别、结合和促使转录的一段核苷酸序列。,转录起始位点：,转录,mRNA,的第一个碱基，多数是,A，,以此作为序列的1，其上游核苷酸序列为“一”，下游核苷酸序列为“”。,基因编码区：,包括起译码,ATG、,开读框和休止码,TAA（TAG、TGA）。,终止子,：,提供转录停止信息的核苷酸序列。,原核,生物结构基因组成,多数以操纵子形式存在，同类功能的多个基因聚在一起，处于同一个启动子调控之下，下游同具一个终止子，但各基因分别有起译码,ATG,和休止码,TAA（TAG、TGA）。,两个基因之间存在长度不等的间隔序列，但有例外。,启动子含,35,序列保守区5,TTGACA3，,10,序列保守区5,TATAAT3。,操纵子除启动子外，往往有一些调控转录的其他因子。,在起译码上游约,10,bp,处，有一,SD,保守区，一般为,AGGA。,转录终止之前常有一段回文序列结构终止子。,真核,生物结构基因组成,基因单独存在，两个基因之间有很长的间隔序列区。,内含子、外显子。,转录启动子有3个保守序列区：,20,-,30,：,TATA,框，,DNA,在此处开始解链；,70,：,CAAT,框，,RNA,聚合酶结合。,更上游：,GC,框，转录调控因子结合。,休止码下游有一保守的,AATAAA,提供转录产物的释放信号。,不具,SD,序列区，核糖体与转录的,mRNA,结合靠,mRNA5,端添加的“帽”结构。,分离目的基因,通过构建,cDNA,文库和基因组文库,产生的,cDNA,只含编码序列，进行表达还须外加启动子、终止子等调控转录元件。,由于,mRNA,在不同组织、不同发育时期的细胞内丰度不同，必须用高丰度的,mRNA,来构建,cDNA,文库。,用,PCR,技术,Gene cloning,DNA,flagments,a.,chromosal,DNA from animal,plants and microbes；,b.,cDNA,from,mRNA,reverse,transcripted,in vitro,c.chemical,synthersized,DNA,insert,foreigh,DNA into,plasmid,transformation,selection and identification,expression analysis,原核生物的人工转化,对于体外连接的重组,DNA,分子，必须采取特殊的保护措施，否则在几小时内就会全部降解。因此在连接后，应尽快引入受体细胞。许多细菌不具有自然转化的能力，需要通过人工诱导才能出现感受态。,competence,自然界中不是所有细菌都能进行自然转化，也不是生长的任何阶段都具有吸收,DNA,的能力，把细菌能从周围环境中吸收,DNA,的生理状态称为,感受态,。,感受态的出现是由于细菌表面出现许多,DNA,结合位点，,这些位点只能与双链,DNA,结合,，而不与单链,DNA,结合。,这说明完整的双链结构对于转化活性来说是必要的；,DNA,的进入和整合均为单链状态。,转化效率决定于三个内在因素:,受体细胞的感受态；,受体细胞的限制酶系统，它决定转化因子在整合前是否被分解；,受体和供体染色体的同源性，它决定转化因子的整合，因为转化因子总是与碱基顺序相同的或相近的受体,DNA,相配合，亲缘关系越近的其同源性也越强。,当,DNA,与细胞在,Ca2+,和,DMSO,存在条件下混合，在水浴中反应2040分钟以后进行45的热脉冲(,heat shock),可增加,DNA,的吸收。,大肠杆菌摄取,DNA,是非选择性,的，而且可以,用异源启动子,启动转录和蛋白质合成，这使得大肠杆菌成为克隆实验的理想系统。,CaCl,2,方法的转化效率一般可达10,6,-10,7,转化子/,g DNA。,关键是,(1)使用对数生长期的细菌；,(2)低温操作。,优点:,简单、稳定、可重复性高。,缺点:,转化效率稍低，而且不能转化大质粒(15,Kb),影响细菌转化频率:,转化,DNA,的浓度、纯度和构型,转化细胞的生理状态,经,CaCl,2,处理后的成活率,转化环境：温度、,pH、,离子浓度,MgCl,2,转化：,Mg,+,对于维持,DNA,稳定性方面，可能起到重要的作用。,克隆子的筛选,利用抗菌素抗性基因等标记,抗性基因、,X-gal,和,IPTG,蓝白斑,双酶切片段重组法,报告基因（,GUS、LUC、NPT-II、CAT）,克隆子的鉴定,酶切,分子 杂交：斑点、,Southern,杂交,PCR,DNA,测序,转录产物检测,翻译产物检测,PEG(,polyethyleme,glycol 6000),适用：,不能形成感受态的,G,+,细菌,用细胞壁降解酶完全除去肽葡聚糖层，使其维持在等渗培养基中，在,PEG,存在条件下，质粒或噬菌体,DNA,可高效地被导入原生质体。,植物细胞转化,Ti,转化法,叶盘转化法、原生质体共培养法、悬浮细胞共培养法,直接转移法,电穿孔、微弹轰击法、激光微束穿孔法、多聚物介导法、花粉管通道法、显微注射法、脂质体介导法。,建立对植物有效转化基本要求：,(1),转化系统不受基因型的限制；,(2),易于获得大量的转基因植株；,(3),尽可能缩短获得转基因植株的周期；,(4),避免使用原生质体作为转基因受体。,基因枪转化方法基本满足了上述要求。,biolistic,transformation,Particle bombardment,Biolistic,process,High-velocity micro projectile,原理：,籍高速运动的金属微粒将附着于其表面的包裹有,DNA,的钨象子弹一样以高压射进细胞并使,DNA,留在细胞内，特别是留在细胞器中。,types of,biolistic,and,tansformation,mechanism,基因枪法：,利用火药爆炸、高压放电或高压气体作为驱动力加速金属粒子(微弹)，使其进入带壁细胞的一种方法。,质粒,DNA,首先沉淀在微弹(钨粉、金粉等)表面(通常以氯化钙、亚精胺作为沉淀剂来促进,DNA,与微弹的结合)，结合有,DNA,分子的微弹经加速而获得足够动量，进而穿透植物细胞壁进入靶细胞，随后释放出,DNA,分子并随机整合到寄主的基因组内。,根据,动力来源,的不同，基因枪大体可以分为,火药式,、,放电式,和,气动式,三种类型,。,Electric discharge,工作原理：,通过高压放电引起水滴气产生冲力，驱,动微弹载体连同微弹加速运动。,“,气动式,”,和,“,放电式,”,都具有精确调节微弹速度,的性能,转化受体要求,：凡具备再生能力的细胞或组织,十分广泛：,原生质体、悬浮细胞、根茎切段、叶圆,片、成熟胚、幼胚、分生组织、愈伤组,织、花粉细胞和胚芽鞘等,选择适当的转化受体材料,：十分关键。最常用有细,胞悬浮系、愈伤组织、,幼胚、成熟胚和茎尖分,生组织,。,影响基因枪转化频率的因素,理化因素：,基因枪的一些轰击参数，包括微弹的速,度、挡板与靶细胞间的距离(射程)、弹,膛内的真空度、轰击次数、,DNA,的纯度,与浓度、微弹的类型、大小及用量以,及,DNA,沉淀剂(氯化钙与亚精胺)的浓度,等。,生理因素：,轰击前后的培养条件,不同生理状态的植物材料接受外源,DNA,的能力是不同的,动物细胞转化,病毒颗粒转导法,磷酸钙转染法,DEAE-,葡聚糖转染法,DMSO（,二,甲基亚砜）转染法,脂质体介导法,显微注射,基因打靶,电穿孔,transformation for,mamalial,animals,磷酸钙沉淀法:,Ca,2+,促进,哺乳动物细胞吸收,外源,DNA,b.,共转化：,将过量的媒介,DNA,与带有,tk,基因的 重组,DNA,混合，用,Ca,2+,沉淀转化细胞。,c.,微量注射：,一台仪器每小时注射500-1000个细胞，约50%的细胞能稳定地整合并表达，任何,DNA,都可注射到任何细胞中，效率高，不需筛选压力，但需要昂贵的仪器，技术复杂，难以掌握。,electroporation,许多细菌和真核系统，无感受态,操作方便、基因转移效率高，适用真核生物和原核生物,方法：,用高压脉冲电流击破细胞膜或击成小孔，使各种大分子(包括,DNA),通过这些小孔进入细胞。,大肠杆菌中，优化参数（电场强度、电脉冲长度、,DNA,的浓度），每微克,DNA,可得到10,9,-10,10,转化体,主要影响因素:,脉冲最大电压：,电压太小，转化效率低；,电压太大，细胞不能成活。,脉冲持续时间,线性化,DNA,有较高的重组机率；,一般电击前后将细胞置冰浴10,min,调节电场强度和脉冲长度使50-75细菌死亡，可得到最高转化效率。,最高转化率可达10,9,-10,10,转化子/,g DNA。,转化率,每毫克转化的质粒,DNA,所产生的具抗生素抗性的克隆数,转化子的增殖与保存,单克隆，接种含选择标记抗生素的液体培养基中，部分菌液冻存于甘油保存液中。,克隆技术的应用,重组,蛋白,GMO,DNA,指纹分析,医学诊断,基因治疗,
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