蛋白质与DNA的相互作用

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,蛋白质与DNA的相互作用,分类：,与单链RNA结合,与茎环结构结合,与双链DNA结合：普遍性结合,特异性结合,蛋白质与DNA结合的特性：,1.DNA识别部位有二度对称性。蛋白质一般是有二度对称结构的二聚体，两个单体具有旋转对称性，与硷基的旋转对称吻合。,2.蛋白质和DNA的接触区只在DNA的一侧。,3.在结合过程中，蛋白质和DNA都有构像改变。,4.普遍性结合：蛋白质中带正电荷氨基酸与DNA骨架的磷酸基团形成离子键。,5.特异性结合：识别螺旋区内氨基酸与DNA特定硷基接触。,蛋白质与DNA的普遍性结合中DNA特点：,蛋白质与DNA主链骨架接触，大多数涉及磷酸二酯键中的氧原子。,与DNA硷基序列特异性无关,结构的匹配性：,旋转对称性,特定距离的相反电荷,形成氢键基团排布上的匹配,形成足够大的范德华力,1.蛋白质和DNA都存在0.7nm 的重复距离,DNA双螺旋单链相邻磷酸基团间的距离是0.7nm。,折叠，N原子间距离是0.7nm,伸展折叠C,间距离是0.7nm,螺旋，Arg和Lys被另外三个残基隔开，带正电荷侧链的距离是0.7nm.,2.DNA对称性,平移对称：,GCATCT GCATCT,CGTAGA CGTAGA,二重轴对称,GCATCT TCTACG,CGTAGA AGATGC,二重旋转对称,GCATCT AGATGC,CGTAGA TCTACG,旋转对称,GCATCT CGTACA,CGTAGA GCATGT,蛋白质与DNA特异性结合中DNA特点：,大沟内存在特异性识别信息,氨基酸与碱基对共平面,氨基酸和碱基对之间形成氢键,N,N,O,H,N,N,N,H,N,N,O,N,H,C,O,O,C,C,N,H,H,N,H,H,H,Glu,Agr,H,蛋白质与DNA普遍结合中蛋白质特点：,-折叠结构的带正电荷残基与磷酸集团结合,可能是通过识别小沟结构实现,1.富含脯氨酸和碱性氨基酸,组蛋白有重复的,SPKK,Ser/Thr-Pro-Lys/ArgLys/Arg,PRGRP序列与A-T碱基对结合,KPRGRPK序列也能与小沟A-T结合,2.碱性螺旋,组蛋白H1C端57个氨基酸,Lys和Gly,Lys在螺旋两侧，Gly夹在中间,3.蛋白磷酸化作用,SP X X：Ser磷酸化,TPKK：Tyr磷酸化,磷酸化后和DNA结合能力下降,磷酸化失去氢键,蛋白质与DNA特异性结合中蛋白质特点：,1.蛋白质多形成二聚体,HTH复合物,同源盒结构,亮氨酸拉链结构,NH,2,COOH,碱性氨基酸Agr和Lys,锌指结构,Agr和G形成氢键,细胞核蛋白质的提取,收集细胞，洗去血清和培养基,裂解细胞：Triton X-100,NP-40,去胞浆成分,裂解细胞核：高浓度KCl:600mM,变更缓冲液浓度,快速抽提,裂解液：提取液：,10mM HRPES 250mM Tris,1mM EDTA 60mM KCl,60mM KCl 1mM DTT,1mM DTT 1mM PMSF,1mM PMSF pH 7.9,0.5%NP-40,pH 7.9,1X10,7,细胞,100ul裂解液、冰浴5分钟、离心,沉淀,用不含NP-40的裂解液洗一次,100ul提取缓冲液,干冰异丙醇速冻，反复冻融3次,离心,沉淀 80,0,C保存,凝胶滞后试验,1.蛋白质和DNA结合复合物半衰期短,电泳缓冲液低离子强度,凝胶的笼效应,2.探针以20-200bp 为宜。过小不利于蛋白结合，过大增加非特异性结合。,3.用竞争性抑制检测DNA与蛋白质结合的特异性,4.加3ug Poly(dI-dC)减少非特异性结合,5.超级凝胶电泳增强蛋白质的凝胶阻滞作用,6.只能确定结合，无法确定序列,DNA足迹分析,DNA足迹分析,1.DNAase,随机水解核苷酸磷酸二酯键,每一个DNA分子最好只切一次,2.蛋白质与DNA结合保护DNA不被切割,3.电泳用的是变性凝胶：,相差一个核苷酸DNA彼此分开,蛋白质从DNA分子上脱落,4.可确定与蛋白质结合的DNA序列,5.DNA序列是固定的,随机PCR,凝胶阻滞试验：蛋白质和DNA结不结合，,不能确定结合的序列,DNA足迹分析：蛋白质结合DNA的序列,不能确定序列硷基变化对,结合的影响,随机PCR:结合序列硷基变化对结合的影响,寡核苷酸设计与合成：,1.AAGAATTCNNNNNNNNNGGATCCAA,2.引物合成,3.标准结合反响寡核苷酸的合成,4.电泳回收,探针标记：,合成的含随机序列的单链寡核苷酸,3,引物,32,PdCTP,dNTP(不包括dCTP),Klenow酶,电泳纯化,凝胶阻滞试验纯化探针,1.蛋白质与标准结合寡核苷酸结合,蛋白质与随机寡核苷酸结合,电泳样品隔开，防污染,2.凝胶回收,3.酚、氯仿去蛋白,4.PCR底物加32PdCTP,5.PCR产物再做凝胶阻滞试验，反复纯化,特异结合序列的克隆和序列分析：,酶切随机核苷酸序列与质粒重组,用引物对质粒序列进行分析,N1 N2 N3 N4 N5,A 14/0.32 13/0.30 4/0.11 5/0.11 14/0.32,C 9/0.21 12/0.27 23/0.52 26/0.59 7/0.16,G 4/0.01 6/0.14 6/0.14 9/0.21 19/0.43,T 17/0.39 13/0.30 11/0.25 4/0.01 4/0.01,T/A A/T/C C C G/A,超过50%：确定不可替换,25-50%：两种硷基可替换,小于25%：没有硷基特异性,SouthWestern杂交试验,确定与DNA结合的蛋白质分子量,蛋白质进行SDS-Page,转移硝酸纤维素膜,与核酸探针杂交,亲和层析纯化DNA结合蛋白,凝胶阻滞检查DNA能否和蛋白质结合,足迹法，测序确定DNA序列,合成DNA,制备亲和层析柱,蛋白过亲和柱纯化,谢谢,