酶分子修饰ppt课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,什么是酶分子修饰？,通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为,酶分子修饰,。,什么是酶分子修饰？通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从,酶分子修饰的意义,稳定酶的天然构象,保护活性部位,维持酶功能结构的完整性,降低酶的抗原性,改变酶学性质,回本章目录,酶分子修饰的意义稳定酶的天然构象回本章目录,第一节 酶的化学修饰,化学修饰,：在体外将酶分子通过人工的方法与一些,化学基团,（物质），进行,共价连接,，从而改变酶的结构和性质,。,即,利用修饰剂所具有的各种化学基团特性，直接或经过一定的活化过程，与酶分子上某氨基酸残基（一般尽量选酶活性非必需基团）产生化学反应，对酶分子结构进行改造,。,第一节 酶的化学修饰化学修饰：在体外将酶分子通过人,一、化学,修饰分类,（一）酶分子主链修饰,（二）酶分子侧链基团修饰,（三）大分子结合修饰,（四）氨基酸置换修饰,（五）金属离子置换修饰,（六）亲和修饰,一、化学修饰分类（一）酶分子主链修饰,（一）,酶分子主链修饰,利用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学结构及其空间结构发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法。,主链切断修饰,主链连接修饰,（一）酶分子主链修饰利用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化,1、,主链切断修饰,主链切断的,三种情况,：,活性中心破坏,失活,活性中心完整保持活性，,改变抗原性,有利于活性中心的形成显示活性或,活力提高,1、主链切断修饰主链切断的三种情况：,胃蛋白酶原的激活,胃蛋白酶原的激活,胰蛋白酶原的激活,胰蛋白酶原的激活,胰凝乳蛋白酶原的激活,胰凝乳蛋白酶原的激活,2、主链连接修饰,将两种或两种以上的酶通过主链连接在一起，形成一个酶分子具有,两种或多种催化活性,。,2、主链连接修饰将两种或两种以上的酶通过主链连接在一起，形成,（二）酶分子侧链基团修饰,酶蛋白的侧链基团：指组成蛋白质的氨基酸残基上的功能团。,包括：氨基（-NH2）、羧基（-COOH）、咪唑基、吲哚基、酚羟基、羟基、胍基、甲硫基等。,（二）酶分子侧链基团修饰酶蛋白的侧链基团：指组成蛋白质的氨基,分子内交联修饰,含有,双功能基团,的化合物（双功能试剂）如戊二醛、己二胺、葡聚糖、二乙醛等，可以在酶蛋白分子中,相距较近,的两个基团之间形成,共价交联,，从而提高酶的,稳定性,的修饰方法,分子内交联修饰含有双功能基团的化合物（双功能试剂）如戊二醛、,（三）酶的大分子修饰,采用,水溶性大分子,与酶蛋白的侧链基团(共价)结合使酶分子的空间构象发生改变，从而改变酶的特性与功能的方法,（三）酶的大分子修饰采用水溶性大分子与酶蛋白的侧链基团(共,非共价修饰,使用一些能与酶非共价地相互作用而又能有效地保护酶的一些添加物，它们既能通过,氢键,固定在酶分子表面，也能通过,氢键,有效地与外部水相连，从而保护酶的活力。,如,多元醇、多糖、多聚氨基酸、,蛋白质,。,非共价修饰使用一些能与酶非共价地相互作用而又能有效地保护酶的,用可溶性大分子，如,聚乙二醇,、右旋糖苷、肝素等，通过,共价键,连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层。,共价修饰,用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通过共价键连接,大分子修饰(共价)的过程,修饰剂的选择,：大分子结合修饰采用的修饰剂是水溶性大分子。例如，聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐、蔗糖聚合物（Ficoll）、葡聚糖、环状糊精、肝素、羧甲基纤维素、聚氨基酸等。要,根据酶分子的结构和修饰剂的特性,选择适宜的水溶性大分子。,修饰剂的活化,：作为修饰剂中含有的基团往往不能直接与酶分子的基团进行反应而结合在一起。在使用之前一般需要经过,活化,，然后才可以与酶分子的某侧链基团进行反应。,修饰,：将带有活化基团的大分子修饰剂与经过分离纯化的酶液，以一定的比例,混合,，在一定的温度、pH值等条件下反应一段时间，使修饰剂的活化基团与酶分子的某侧链基团以共价键结合，对酶分子进行修饰。,分离,：需要通过,凝胶层析,等方法进行分离，将具有,不同修饰度的酶分子,分开，从中获得具有较好修饰效果的修饰酶。,大分子修饰(共价)的过程修饰剂的选择：大分子结合修饰采用的修,应用最广的修饰剂,聚乙二醇,是线性分子，溶解度高，具有良好的生物相容性，在体内无毒性、无残留、无抗原性，分子末端有可活化的,羟基,，活化后可以与酶产生交联，因而，它被广泛用于酶的修饰。,可用多种不同试剂,活化,，修饰不同基团,聚乙二醇均三嗪、聚乙二醇琥珀酰亚胺,聚乙二醇马来酸酐、聚乙二醇胺,应用最广的修饰剂聚乙二醇是线性分子，溶解度高，具有良好的生物,将酶分子肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸的修饰方法称为,氨基酸置换修饰,(四)氨基酸置换修饰,将酶分子肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸的修饰方法称为氨,氨基酸或核苷酸的置换修饰可以采用,化学修饰方法,例如，Bender等成功地利用化学修饰法将枯草杆菌蛋白酶活性中心的,丝氨酸转换为半胱氨酸,，修饰后，该酶失去对蛋白质和多肽的水解能力，却出现了催化硝基苯酯等底物水解的活性。,化学修饰法,难度大，成本高，专一性差,，而且,要对酶分子逐个进行修饰,，操作复杂，难以工业化生产。,1.化学修饰方法氨基酸置换,氨基酸或核苷酸的置换修饰可以采用化学修饰方法1.化学修饰方法,2.定点突变法氨基酸置换,现在常用的氨基酸置换修饰的方法是,定点突变技术,。定点突变（,site directed mutagenesis,）是20世纪80年代发展起来的一种基因操作技术。是指在DNA序列中的某一,特定位点,上进行碱基的改变从而获得突变基因的操作技术。是蛋白质工程（,Protein Engineering,）和酶分子组成单位置换修饰中常用的技术。定点突变技术，为氨基酸或核苷酸的置换修饰提供了,先进、可靠、行之有效,的手段。,2.定点突变法氨基酸置换现在常用的氨基酸置换修饰的方法是定点,定点突变过程,1、酶分子结构设计（根据已知的酶结构和其存在的问题）,2、突变基因序列的确定（考虑物种差异）,3、突变基因的获得（DNA合成仪PCR）,4、新酶的获得（重组、转入宿主、表达）,定点突变过程1、酶分子结构设计（根据已知的酶结构和其存在的问,（五）金属离子置换修饰,1、概念,2、作用范围,3、常用金属离子,4、方法步骤,（五）金属离子置换修饰1、概念,1、概念,通过改变酶分子中所含金属离子，使酶的特性和功能发生改变的方法。,1、概念通过改变酶分子中所含金属离子，使酶的特性和功能发生改,2、作用范围,含有金属离子的酶,金属酶特点：金属离子往往是酶活性中心的组成部分，对酶的活性起重要作用。,（1）若除去酶活性中心的金属离子，酶会失活，重新加入原离子则酶复活。,（2）加入不同的金属离子（即金属离子置换）则可使酶呈现不同特性。,2、作用范围含有金属离子的酶,3、常用金属离子,（往往是二价离子）:Ca,2+,，Mg,2+,，Mn,2+,，Zn,2+,，Co,2+,，Cu,2+,，Fe,2+,等。,3、常用金属离子,4、,金属离子置换修饰的过程,a.,酶的分离纯化,：首先将欲进行修饰的酶经过分离纯化，除去杂质，获得具有一定纯度的酶液。,b.,除去原有的金属离子,：在经过纯化的酶液中加入一定量的金属螯合剂，如乙二胺四乙酸（EDTA）等，使酶分子中的金属离子与EDTA等形成,螯合,物。通过透析、超滤、分子筛层析等方法，将EDTA-金属螯合物从酶液中,除去,。此时，酶往往成为无活性状态。,c.,加入置换离子,：于去离子的酶液中加入一定量的另一种金属离子，酶蛋白与新加入的金属离子结合，除去多余的置换离子，就可以得到经过金属离子置换后的酶。,金属离子置换修饰只适用于那些在分子结构中本来含有金属离子的酶。,用于金属离子置换修饰的金属离子，一般都是二价金属离子。,4、金属离子置换修饰的过程 a.酶的分离纯化：首先将欲进,（六）亲和修饰,亲和标记是一种特殊的化学修饰方法，它利用酶与底物的亲和能力，使用与底物或配体结构类似的修饰剂，对酶活性中心上的氨基酸残基进行共价修饰修饰。,亲和标记,光化学标记,（六）亲和修饰亲和标记是一种特殊的化学修饰方法，它利用酶与底,二、酶修饰后的性质变化,热稳定性,：一般来说，热稳定性有较大的,提高,。,抗原性,：比较公认的是PEG和人血清白蛋白在,消除,酶的抗原性上效果比较明显。,各类失活因子的抵抗力,：修饰酶对蛋白酶、抑制剂均有一定的抵抗能力，从而,提高,其稳定性。,半衰期,：一般在体内的半衰期得到有效延长。由于酶分子经修饰后，增强对热、蛋白酶、抑制剂等的稳定性，从而,延长,了在体内的半衰期。,最适pH,：大部分酶经化学修饰后，酶的最适pH发生了变化，这种变化在应用研究上有时具有重要意义。修饰酶最适pH更接近于,生理,环境，在临床应用上有较大意义。,Km的变化,：大多数酶经修饰后，Vm没有明显变化，但有些酶经修饰后，Km值,变大,。,回本章目录,二、酶修饰后的性质变化热稳定性：一般来说，热稳定性有较大的提,三、化学修饰方法的几个问题,决定化学修饰成败的关键是修饰的专一性，尽量少破坏必需基团，得到高的酶活力回收。为此，有时需要通过反复试验来确定。其中：,对酶性质的了解：,活性部位、稳定条件、反应最佳条件及侧链基团性质等；,选择修饰剂考虑：,1）分子量、修饰剂链长和对蛋白吸附性；2）修饰剂上反应基团的数目及位置；3）修饰剂上反应基团的活化方法和条件（一般要求较大分子量、良好的生物相容性和水溶性、分子表面有较多反应活性基团）；,选择酶反应条件要注意：,1）反应体系的溶剂性质、盐浓度、PH、温度、时间；2）酶与修饰剂的比例。,参考：酶工程 P.86,三、化学修饰方法的几个问题 决定化学修饰,四、酶化学修饰的应用,在医药方面：,化学修饰可以提高医用酶的,稳定性,，延长,它在体内半衰期，抑制免疫球蛋白的产生，降低免疫原性,和,抗原性,。,在生物技术领域：,化学修饰酶能够提高酶对热，酸，碱,和有机溶剂的耐性，改变酶的底物专一性和最适pH等酶学,性质。,在酶结构功能研究中：,1.研究酶空间结构与功能的关系，如酶的活性中心研究；,2.确定氨基酸残基的功能；,3.测定酶分子中某种氨基酸的数量。,四、酶化学修饰的应用 在医药方面：化学修饰可以提高医用,五、酶蛋白化学修饰的局限性,1.某种修饰剂对某一氨基酸侧链的化学修饰,专一性,是,相对的,，很少有对某一氨基酸侧链绝对专一的化学修饰剂。,2.化学修饰后酶的,构象或多或少都有一些改变,，因此这种构象的变化将妨碍对修饰结果的解释。,3.酶的化学修饰,只能在具有极性的氨基酸残基侧链上进行,，目前还不能用化学修饰的方法研究非极性氨基酸残基在酶结构与功能关系中的作用。,4.酶化学修饰的结果对于研究酶结构与功能的关系能提供一些信息，如某一氨基酸残基被修饰后，酶活力完全丧失，说明该残基是酶活性所“必需”的，为什么是必需的，还得用X射线和其他方法来确定。因此化学修饰法研究酶结构与功能关系尚,缺乏准确性和系统性。,五、酶蛋白化学修饰的局限性1.某种修饰剂对某一氨基酸侧链的化,第二节,酶分子的物理修饰,通过物理方法使酶分子的空间构象发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的方法,通过物理修饰，可以了解不同物理条件下，特别是在极端条件下（高温、高压、高盐、极端pH值等）由于酶分子空间构象的改变而引起酶的特性和功能的变化情况。,特点在于不改变酶的组成单位及其基团，酶分子中的,共价键不发生改变,，只是在物理因素的作用下，副键发生某些变化和重排。,第二节 酶分子的物理修饰 通过物理方法使酶分子的空间构象发生,变性、诱导与构象重建,（对酶高级结构调整）,酶肽链,变性,松散后，使其在有底物类似物或抑制剂存在的非天然条件下,复性,，酶将折叠成所需要的特殊结构，产生新的性状，此即变性诱导构象重建的原理。,变性、诱导与构象重建 （对酶高级结,实验证据：在8mol/L尿素存在下，用巯基乙醇处理天然Rnase（核糖核酸