质粒酶切鉴定课件

,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,1.,实验目的和要求,学习和掌握限制性内切酶的特性、酶解和琼脂糖凝胶电泳的操作方法，并理解限制性内切酶是,DNA,重组技术的关键工具，琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定,DNA,片段的有效方法。,1.实验目的和要求,1,2.,相关基础知识,限制性核酸内切酶：是一类能识别双链,DNA,分子特异性核酸序列的,DNA,水解酶。是体外剪切基因片段的重要工具，所以常常与核酸聚合酶、连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶。限制性核酸内切酶不仅是,DNA,重组中重要的工具，而且还可以用于基因组酶切图谱的鉴定。,2.相关基础知识,2,1),寄主控制的限制与修饰现象,2),核酸限制性内切酶的类型,3),核酸限制性内切酶的基本特性,4),同裂酶和同尾酶,5),核酸限制性内切酶的命名法,6),影响核酸限制性内切酶活性的因素,1)寄主控制的限制与修饰现象,3,1),寄主控制的限制与修饰现象,限制与修饰系统是细胞的一种防卫手段。各种细菌都能合成一种或几种能够切割DNA双链的核酸内切酶，它们以此来限制外源DNA存在于自身细胞内，但合成这种酶的细胞自身的DNA不受影响，因为这种细胞还合成了一种修饰酶，对自身的DNA进行了修饰，限制性酶对修饰过的DNA不能起作用。这种现象被称为寄主控制的限制与修饰现象。,1)寄主控制的限制与修饰现象限制与修饰系统是细胞的一种防卫,4,2)限制性核酸内切酶的类型及特性,按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切断核酸的情况不同，分为三类：,型,型*,型,2)限制性核酸内切酶的类型及特性,5,第一类（I型）限制性内切酶,能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结构或克隆基因。这类酶如EcoB、EcoK等。,第一类（I型）限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点,6,第二类,(II,型,),限制性内切酶,能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。因此，这种限制性内切酶是,DNA,重组技术中最常用的工具酶之一。这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是,4,个或,6,个核苷酸，少数也有识别,5,个核苷酸以及,7,个、,8,个、,9,个、,10,个和,11,个核苷酸的。,II,型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序，即有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向“读”都完全相同。这种酶的切割可以有两种方式：,第二类(II型)限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺,7,粘性末端；是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。,如EcoRI的识别顺序为：,5 GAA|TT_C 3,3 C_TT|AAG 5,垂直线表示中心对称轴，从两侧“读”核苷酸顺序都是GAATTC或CTTAAG，这就是回文顺序（palindrome）。_和表示在双链上交错切割的位置，切割后生成5G和AATTC3、3CTTAA和G5二个DNA片段，各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合”。,粘性末端；是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸,8,II,型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端。例如,EcoRV,的识别位置是：,5 GAT|ATC 3,3 CTA|TAG 5,切割后形成,5 GAT,和,ATC 3,、,3 CTA,和,TAG 5,。这种末端同样可以通过,DNA,连接酶连接起来。,平头末端：,II型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端,9,第三类（,III,型）限制性内切酶,也有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序,在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度,DNA,片段，具有各种单链末端。因此不能应用于基因克隆。,第三类（III型）限制性内切酶也有专一的识别顺序，但不是对,10,同裂酶：,有时两种限制性内切酶的识别核苷酸顺序和切割位置都相同，其差别只在于当识别顺序中有甲基化的核苷酸时，一种限制性内切酶可以切割，另一种则不能。例如,Hpa,和,Msp,的识别顺序都是,5GCG_G3,，如果其中有,5-,甲基胞嘧啶，则只有,Hpa,能够切割。这些有相同切点的酶称为,同裂酶（同切酶或异源同工酶）,。,3,）同裂酶和同尾酶：,同裂酶：3）同裂酶和同尾酶：,11,有时两种酶切割序列不完全相同，但却能产生相同的粘性末端，这类酶被称为,同尾酶,，可以通过,DNA,连接酶将这类末端连接起来，但原来的酶切位点将被破坏，有时可能会产生一个新的酶切位点。如,Xba1,、,Nhe1,、,Spe1,以及,Styl,切割的,DNA,序列不同，但均给出相同的“,CTAG”,粘性末端。这些粘性末端连接后，以上的酶将不能再切割，但却产生了一个新的,4,核苷酸的酶切位点，即,Bfa1,的酶切位点。,同尾酶：,有时两种酶切割序列不完全相同，但却能产生相同的粘性末端，这类,12,4),限制性核酸内切酶的命名法,用属名的头一个字母和种名的头两个字母表示寄主菌的物种名称，如,E.coli,用,Eco,表示，所以用斜体字。,用一个字母代表菌株或型，如流感嗜血菌,Rd,菌株用,d,，即,Hin,d,。,如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的限制与修饰体，则以罗马数字表示，如,Hin,d,Hin,d,，,Hin,d,等。,4)限制性核酸内切酶的命名法,13,5),影响核酸限制性内切酶活性的因素,(1)DNA,的纯度；,(2)DNA,的甲基化程度；,(3),酶切消化反应的温度；,(4)DNA,的分子结构；,(5),溶液中离子浓度及种类；,(6),缓冲液的,pH,值。,5)影响核酸限制性内切酶活性的因素,14,琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖凝胶电泳是利用琼脂糖溶化再凝固后能形成带有一定孔隙的固体基质的特性，其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场的作用下及中性,pH,的缓冲条件下带负电的核酸分子就可以向阳极迁移。,影响,DNA,在琼脂糖中迁移率的因素：,DNA,分子的大小、,DNA,的构象、电压、电场方向、碱基组成、嵌入的燃料以及电泳缓冲液的组成。,琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是利用琼脂糖溶化再凝固后能形成带,15,琼脂糖凝的浓度影响给定大小的线状,DNA,的迁移率，因此采用不同浓度的凝胶可以分离不同大小范围的,DNA,片段。,0.8%,的琼脂糖凝胶能很好地分辨,1-25kb,的片段；,0.5%,的琼脂糖凝胶用于分辨较大片段的,DNA(20-100kb,）；对于小片段的,DNA(0.2-2kb),可用,1.5%,或更高浓度的凝胶进行分离。不过，以上这些并不是绝对的，因为有时我们需要同时分离多种分子量相差较大的片段，因此所用琼脂糖凝胶的浓度要视情况而定。,琼脂糖凝的浓度影响给定大小的线状DNA的迁移率，因此采用不同,16,EB：即3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲锭溴盐,(Ethidium Bromide)。它能够插入DNA分子中的碱基对之间而与DNA结合。由于EB分子的插入，在紫外光的照射下，凝胶电泳中的DNA条带呈现出红色荧光，易于检测。可以检测10ng 的DNA。,注意：EB是一种诱变剂，操作时一定要注意安全操作，必须戴塑料或乳胶手套,。,EB：即3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲锭溴盐,(Et,17,3.,实验材料与仪器,质粒,pCMV-Myc-T10,NEB,标准分子量片段,(1kb DNA Ladder),EcoR1,和,Xho1,核酸内切酶（,Takara,）,EcoR,1,和,Xho,1,酶解缓冲液,(10H buffer),琼脂糖,TBE,或,TAE,缓冲液,(10),溴化乙啶染色液,(10mg/ml),上样液,(6),：,0.25%,溴酚兰，,40,(W/V),蔗糖 水溶液或,30,的甘油。,3.实验材料与仪器TBE或TAE缓冲液(10),18,Insert,EcoR1,Xho1,1.9kb,质粒,InsertEcoR1Xho11.9kb质粒,19,质粒酶切鉴定课件,20,1 kb DNA Ladder,不能对,DNA,质量进行精确定量分析，但可以通过与相近的条带进行比较估算出大概的数据。每条带大概的量如下（按,0.5g,上样量计。应按,12,条带计算，因为,3kb,的量是其它片段量的近三倍）：,片段,碱基对,质量,1,10,002,42 ng,2,8,001,42 ng,3,6,001,50 ng,4,5,001,42 ng,5,4,001,33 ng,6,3,001,125 ng,7,2,000,48 ng,8,1,500,36 ng,9,1,000,42 ng,10a,517,42 ng*,10b,500,42 ng*,1 kb DNA Ladder不能对DNA质量进行精确定量分,21,EcoR,I,酶切位点：,GAATT_C,Xho,I,酶切位点：,CTCGA_G,10H buffer:500mM Tris-HCl(pH7.5),100mM MgCl,2,10mM Dithiothreitol,1000mM NaCl,EcoR I 酶切位点：GAATT_C,22,酶活性的定义：,一个活性单位（,U),，是指在,50,l,反应体系中，,37,o,C,的条件下，经过,1,小时的反应时间，将,1,g,DNA,完全酶解所需要的酶量。,因为不同的酶所要求的最适反应条件不同，所以一定要使用与酶相匹配的缓冲系统。一般按照销售酶的公司所提供的相应缓冲液。双酶切或多酶切时要考虑相容性缓冲液问题，一般公司会给用户提供这方面的信息。,酶活性的定义：,23,电泳仪，电泳槽，紫外透射仪，凝胶成像仪，一次性塑料手套等,电泳仪，电泳槽，紫外透射仪，凝胶成像仪，一次性塑料手套等,24,4.,实验方法和步骤,4.实验方法和步骤,25,质粒量（,ng,）,缓冲液,(l)*,EcoR,1,（,l,）,Xho,1,（,l,）,H,2,O,(l),总体积（,l,）,I,200,2,0,0,17-19,20,II,200,2,0.5,0,15-17,20,III,200,2,0.5,0.5,14-16,20,*缓冲液随不同的酶而不同,本实验用,H buffer,。,置于,37,水浴酶解,0.5-1,小时。酶解完成后，分别加入,10,l,3,倍的上样缓冲液,然后各取,15,l,进行电泳分析。,1),质粒,DNA,的酶解（自提质粒,pCMV-Myc-T10,）,质粒量（ng）缓冲液EcoR1Xho1H2O总体积（l）I,26,2),琼脂糖凝胶的制备,琼脂糖凝胶液的制备：称取,0.8g,琼脂糖，置于三角瓶中，加入,100ml TBE,或,TAE,工作液，瓶口倒扣一个小烧杯等，将该三角瓶置于微波炉加直至琼脂溶解。,2)琼脂糖凝胶的制备,27,3,）胶板的制备,取有机玻璃内槽，洗净、晾干；取纸胶条,(,宽约,1cm),，将有机玻璃内槽置于一水平位置模具上，放好梳子。,3）胶板的制备,28,将冷却至,65,左右的琼脂糖凝胶液，小心地倒在有机玻璃内槽上，控制灌胶速度和量，使胶液缓慢地展开，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。,室温下静置,30min,左右，待凝固完全后，轻轻拔出梳子，在胶板上即形成相互隔开的上样孔。制好胶后将铺胶的有机玻璃内槽放在含有,0.5-1,TAE,（,Tris-,乙酸）,或,TBE,（,Tris-,硼酸）工作液的电泳槽中使用。,将冷却至65左右的琼脂糖凝胶液，小心地倒在有机玻璃内槽上，,29,4,）加样,用微量加样器将上述样品分别加入胶板的样品孔内。每加完一个样品，换一个加样头。加样时应防止碰坏样品孔周围的凝胶面以及穿透凝胶底部，本实验样品孔容量约,15,20,l,。,1 kb DNA ladder