第二章-生化制药基本技术生化制药技术课件

,*,*,第三章 生物制药的基本技术,Basic Technique For Biopharmacon,第三章 生物制药的基本技术Basic Technique,1,第二章 生物制药基本技术,生物制药,是把生物体内的具有生物活性的基本物质，,保持原来的结构和功能,，又能在含有多种物质的液相或固相中,较高纯度的分离出来,。它是一项严格、细致、复杂的工艺过程，涉及物理、化学、生物学、工程等方面的知识和操作技术。,对于一个新研制的生物药物，从查阅文献开始，到探索实验、条件考察（记录客观）、总结制定工艺规程、制定分析鉴定方法，再进行中试放大，全面考察工艺是否成熟，是否稳定等。,问题：,1,、标准化方法？,2,、如何发现或研制新药？,第二章 生物制药基本技术生物制药是把生物体内的具有生物活性,2,基本制造方法,1,、提取法,(Extraction),2,、发酵法（,Zymotechnics,）,3,、化学合成（,Chemical synthesize,）,4,、组织培养法（,Tissue culture,）,5,、现代生物技术,(Modern Biotechnics):,Gene engineering,Enzyme engineering,Cell engineering,protein Engineering,Fermentation engineering,基本制造方法1、提取法(Extraction),3,生化制药的六个阶段,1.,原料的选择和预处理,2.,固液分离,3.,提取,：从原料中经溶剂分离有效成分，制成粗品的工,艺过程。,4.,精制,/,纯化,：粗制品经盐析、有机溶剂沉淀、吸附、层析、透析、超离心、膜分离、结晶等步骤进行精制的工艺 过程。,5.,成品加工,/,浓缩、干燥及保存、制剂,：原料药（精制品）经精细加工制成片剂、针剂、冻干剂、粉剂等供临床应用的各种剂型。,生化制药的六个阶段 1.原料的选择和预处理,4,一、原料选择和预处理（,Raw Material Selecting and Pretreatment,）,原料选择的基本准则,：,1,、在大量的信息资料和实践经验的基础上，选择目标原料。,2,、选择有效成分含量高的新鲜材料；,3,、来源丰富易得；,4,、制造工艺简单易行；,5,、成本比较低；,6,、原料的采集不破坏生态环境,选择对环境友好的原材料资,源，防止生物入侵。,一、原料选择和预处理（Raw Material Selec,5,预处理方法,：,1,、动物组织先要剔除结缔组织、脂肪组织等非活性部分；植物种子去壳除脂；微生物要进行菌体与发酵液分离等基本操作。便于贮存和运输。,2,、冷冻法预处理：有些材料要冷冻保存或低温保存，以便抑制微生物和酶的作用。,3,、有机溶剂除去部分水分：用丙酮或乙醇进行脱水和脱脂，有利于贮存。,预处理方法：,6,原料的粉碎,：,在提取前先将大块的原料粉碎或绞碎成适度的粒度，或将细胞破碎，使胞内活性物质充分释放到溶液中，有利于提取或吸附。,动物脏器组织：常用绞肉机机械法粉碎；,植物肉质组织：常用磨碎法；,微生物：常用自溶、冷热交替、加砂研磨、超声、加压等 处理方法。,原料的粉碎：在提取前先将大块的原料粉碎或绞碎成适度的粒度，或,7,1.,机械法,：,组织捣碎机、匀浆器、研钵、球磨机、万能粉碎机、绞肉机、击碎机、刨片机。,动物组织多在冰冻状态绞碎、溶浆。,2.,物理法,A,、,反复冻融法,：,把待破碎的样品冷至,-20-15,，使 之凝固，然后缓慢的溶解，如此反复操作，大部分动物性,细胞及细胞内的颗粒可以破碎。,B,、,冷热交替法,：将材料投入沸水中，在,90,左右维持数分钟，立即置于冰浴中，使之迅速冷却，绝大部分细胞被破坏。此法多用于细菌或病毒中提取蛋白和核酸。,1.机械法：组织捣碎机、匀浆器、研钵、球磨机、万能粉碎机、绞,8,C,、,超声波处理法,：,多用于微生物材料，处理的效果与,样品浓度、使用频率有关。用大肠杆菌制备各种酶,时，常用,50100mg/L,菌体浓度，在,110KC,频率下,处理,1015min,。操作时注意避免溶液中气泡的存在。,D,、,加压破碎法,：加气压或水压，达,0.5934.32MPa,(210350kgf/cm,2,),的压力时，可使,90%,以上细胞被,压碎。多用于微生物酶制剂的工业制备。,C、超声波处理法：多用于微生物材料，处理的效果与,9,3.,生化及化学法,：,A.,自溶法,：将新鲜的生物材料存放在一定的,pH,和适当温度下，利用组织细胞中自身的酶系将细胞破坏，使细胞内含物释放出来的方法。自溶的温度，动物材料在,0-4,，微生物在室温下。自溶时，需加少量的防腐剂，甲苯、氯仿，以防止外界细菌的污染。,*由于自溶时间较长，不易控制，故制造具有活性的核酸和蛋白质时比较少用。,3.生化及化学法：,10,B.,溶菌酶处理法,：溶菌酶是专一地破坏细菌细胞壁的酶。多用于微生物，对蜗牛酶、纤维酶及植物细胞也适用。如用噬菌体感染大肠杆菌细胞制造,DNA,时，采用,pH8.0,的,0.1mol/L Tris-0.01mol/L EDTA,制成,2,亿,/ml,的细胞悬液，然后加 入,100g1mg,的溶菌酶，在,37 C,保温,10min,，细菌胞壁即被破坏。,C.,表面活性剂处理法,：表面活性剂的分子中，兼有亲脂性和亲水性基团，能降低水的界面张力，具有乳化、分散、增溶作用。常用有：,SDS,、氯化十二烷基吡啶、去氧胆酸钠。,B.溶菌酶处理法：溶菌酶是专一地破坏细菌细胞壁的酶。多,11,提取：,也称抽提、萃取，就是利用一种溶剂对物质的不同溶解度，从化合物中分离出一种或几种组分的过程。分为固体处理（液,固萃取）和液体处理（液,液萃取）。,提取条件的选择,：,1,、溶剂,:,常用水、稀盐、稀酸、稀碱，有机溶剂如乙醇、丙酮、氯仿、四氯化碳、丁醇等。丁醇提取的,pH,、温度范围较广（,pH3-6,-2-40,）。适用于动植物和微生物原料。,2,、,pH:,与溶解度和稳定性有很大关系，一般选择在,pI,的两侧。,三、提 取,Extraction,提取：也称抽提、萃取，就是利用一种溶剂对物质的不同溶解度，从,12,3,、温度：一般在,5,以下，但对温度耐受力较大的药物，可适当的提高温度，使杂蛋白变性分离，有利于提取和纯化。如胃蛋白酶、酵母醇脱氢酶及多肽激素类，选择,37-50,提取，效果较好。,影响提取的因素：,1,、被提取物质溶解度的大小：一般极性对极性；非极性对非极性；高温；远离等电点。,2,、扩散作用的影响：,3,、分配作用的影响：分配定律,3、温度：一般在5 以下，但对温度耐受力较大的药物，可适,13,四、分离纯化,Separation and Purification,1,、盐析法,利用不同的蛋白质在高浓度盐溶液中，溶解度不同程度的降低来进行分离纯化。在低盐浓度下，溶解度随着盐浓度升高而增加，称,盐溶作用,；当盐浓度不断升高时，不同蛋白质的溶解度又以不同程度下降并先后析出沉淀，称,盐析作用,。,优点,：设备和条件要求低，安全应用范围广泛。在高盐情况下，蛋白质不易发生变化，一般在室温下操作。,缺点：,分级分离能力不高。,常用的中性盐,：硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠,。,四、分离纯化Separation and Purificat,14,盐析时应注意的几个问题：,（,1,）,盐饱和度,：由于蛋白质的结构和性质不同，盐析要求的饱和度也不同。要按工艺要求，正确计算饱和度。,（,2,）,pH,值的选择,：蛋白质在,pI,时的溶解度最小。因此，进行盐析时的,pH,，要选择在被分离蛋白质的,pI,附近。,（,3,）,蛋白质浓度,：在相同条件下，蛋白质浓度越大越易沉淀，使用盐的饱和度极限也愈低。蛋白质浓度愈高，其他蛋白质共沉作用也愈强，这是不希望的。选择适当的蛋白质浓度，可避免共沉的干扰。,盐析时应注意的几个问题：,15,（,4,）,温度,：一般在室温下进行，浓盐对蛋白质有保护作用。但对温度敏感的，要在低温下进行。,常在,0-4,范围内迅速操作。,如尿激酶。,（,5,）盐析沉淀物的,脱盐,：盐析的沉淀分离后，经脱盐才能获得纯品。最常用的脱盐方法是透析，时间一般较长，应常换透析液，注意防止污染。,2,、有机溶剂沉淀法,利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中的溶解度差异而分离目的蛋白质的方法。蛋白质的沉淀与溶解，与溶剂的介电常数有关。降低溶液的介电常数，使其溶解度变小，同时，还破坏蛋白质的水化膜而使蛋白质沉淀析出。,（4）温度：一般在室温下进行，浓盐对蛋白质有保护作用。但对,16,几种溶剂的介电常数,溶剂名称,20,时的介电常数,溶剂名称,20,时的介电常数,乙醚,4.33,甲醇,33,丙酮,21.4,水,80,乙醇,24 2.5mol/L,甘氨酸水溶液,137,经验,：如,30-40%,乙醇沉淀的物质，改用丙酮时，其体积分数可减少,10%,左右。即可用,20-30%,的丙酮；而,7,0-80%,乙醇沉淀的物质，可用,50-60%,的丙酮即可。,注：水有较高的介电常数，具有很好的溶剂性能，是一种广谱溶剂。有机溶剂法比盐析法分辨力强，沉淀也好过滤，易干燥，但对有些生物活性物质能引起失活和变性。应用时还要注意挥发和火灾等。,几种溶剂的介电常数,17,有机沉淀法应注意的问题,（,1,）,控制工艺过程的温度,：整个操作过程应在低温下进行，而且最好是同一温度。,（,2,）,防止溶剂局部浓度过高,：加入有机溶剂时搅拌要均匀，速度要适当，避免局部浓度过高，引起沉淀物的破坏、变性或失活。,（,3,）,及时处理沉淀物,：沉淀物经过滤或离心后，要立即用水或缓冲液溶解，降低有机溶剂的浓度。,（,4,）,pH,的选择,：在待沉淀蛋白质的,pI,附近。,（,5,）有机溶剂是酶和蛋白质的,变性因素,，尤其是对敏感酶类。,有机沉淀法应注意的问题 （1）控制工艺过程的温度：整个操作,18,3,、等电点沉淀法,利用蛋白质在等电点时的溶解度最低，而各种蛋白质又具有不同的等电点的特性进行分离的工艺过程。,由于各种蛋白质在等电点时，仍有一定的溶解度而沉淀不完全，多数蛋白质的等电点又都十分接近，所以单独使用效果不理想，分辨力差，多用于提取后除杂蛋白。实际生产中常与有机溶剂沉淀法、盐析法联合使用。,3、等电点沉淀法,19,4,、膜分离法,膜分离技术包括：超滤、反渗透析、电渗析、微孔过滤、气体渗析和超精密过滤。,（,1,）超滤：根据溶质分子和悬浮粒子是否通过多孔膜来进行筛分。在液压的驱动下，能通过超滤膜的分离粒子的范围，一般在,0.0010.01m,。即利用一种特制的膜对溶液中的各种溶质分子进行选择性过滤。,优点,：成本低、操作方便、条件温和、能较好地保持药物活性、回收率高。适用于酶和蛋白质药物的分离、浓缩、脱盐、提纯、除菌、除病毒和热原。,4、膜分离法,20,（,2,）反渗透：以高分子透过性薄膜为分离介质，在超过溶液渗透压力的情况下，使溶液中的溶剂透过薄膜，同时使溶质和不溶物阻截在膜前。这一过程类似于渗透,但方向相反，即溶剂从高浓度一侧传递到浓度低的一侧，故称反渗透。,特点,：能耗少，体积小，适应大规模生产。,（,3,）微孔滤膜：由高分子材料制成的薄膜过滤介质，可以过滤一般介质不能截留的细菌和微粒。膜的孔径在,0.2-10 m,。,（,4,）超精密过滤：以聚乙烯醇为主体的中空多孔滤膜，分级性能在超滤膜与微孔滤膜之间。为,0.010.2 m,。用于水的精制、循环水的净化、除悬浮固体粒子以及糖液、酶液的精制。,（2）反渗透：以高分子透过性薄膜为分离介质，在超过溶液渗透压,21,5,、离子交换层析,采用不溶性高分子化合物作为离子交换剂，分离纯化各种生化物质。,基本原理,：离子交换树脂在水中能溶胀，溶胀后，其分子中的极性基团（活性基团），具有可扩散的离子，能与溶液中的离子起交换作用；非极性基团作为树脂的骨架，使树脂不溶于水并具有网状结构，为离子交换的进行及溶液和树脂的分离创造了条件。离子交换层析包括吸附、吸收、穿透