cyp2c19基因多态性与丙戊酸血药浓度相关性1课件

单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,厦门大学医学院本科毕业论文,*,厦门大学医学院本科毕业论文,CYP2C19,基因多态性与丙戊酸血药浓度相关性研究,答 辩 人：罗 静,指导教师：童卫杭 主管药师,厦门大学医学院本科毕业论文CYP2C19基因多态性与丙戊酸血,主要内容,研究背景,1,实验方法,2,实验结果,3,分析讨论,4,主要内容研究背景1实验方法2实验结果3分析讨论4,第一部分 研究背景,药物耐受及低药效,毒副作用及不良反应,AEDs,需合理的临床,个体化用药,传统的,“,标准化用药,”,癫痫,第二大神经系统顽症,一线抗癫痫药（,AEDs,）,体内代谢个体差异大,第一部分 研究背景药物耐受及低药效毒副作用及不良反应AED,丙戊酸钠（,Sodium Valproate,VPA,）,一线抗癫痫药，目前仍无法取代,可用于多种类型的癫痫发作,图,1.,丙戊酸分子结构,Fig.1 molecular structure of valproic acid,相线粒体内,-,氧化,相尿苷酸二磷酸葡萄糖醛酸酶,(UGT),的酸化,细胞色素,P450,酶,(CYP450),的代谢,未发现相关酶的基因多态性,UGT,酶基因的突变位点及突变频率未知,CYP2C19,中国人群突变率较高，突变位点研究成熟,药代动力学（,PK,）复杂，个体差异大,体内,代谢途径,相关酶的,基因多态性,研究,CYP2C19,基因多态性与丙戊酸血药浓度相关性具有临床研究价值,丙戊酸钠（Sodium Valproate,VPA）图1.,CYP2C19,最主要的两个突变位点,CYP2C19*2:,第,5,外显子,681,位,GA,CYP2C19*3:,第,4,外显子,636,位,GA,基因型鉴定：聚合酶链反应,-,限制性片段长度多态性分析（,PCR-RFLP,）,PCR,：模拟体内,DNA,复制条件，体外酶促合成特异,DNA,片段的循环反应，以,扩增目的,DNA,。,RFLP,：某种限制性内切酶,特异性识别,位点，对,DNA,切割；,基因突变时特异性酶切位点,消失,，不被限制性内切酶切断；,利用,电泳检测,，观察条带分析基因型。,PCR-RFLP,特点：,操作简便，耗时耗费低,本实验中将采用准确度受公认的,基因测序法验证,该法的,准确性,产生终止密码，过早终止蛋白合成，产生无活性,CYP2C19,酶，降低对丙戊酸代谢,CYP2C19最主要的两个突变位点产生终止密码，过早终止蛋白,第二部分 实验方法,一、数据收集,2008,年,9,月至,2009,年,4,月,第二炮兵总医院神经内科、神经外科门诊及住院部,服用丙戊酸钠的癫痫患者,49,例,筛选资料齐全的,30,例,记录性别、年龄、体重、治疗药物、治疗剂量、治疗药物血药浓度、合并用药等情况。,二、,血药浓度检测,荧光偏振免疫法（,FIP,）,美国,Abbott,公司,TDxFLx,荧光偏振免疫测定仪及配套试剂盒,服用丙戊酸至少,5,个半衰期（,2-2.5,天）后，血药浓度达稳态时，于下次服药前，采抗凝静脉血,4ml,。,离心，取上清液（血浆）,100,l,，进样测定。,第二部分 实验方法一、数据收集,三、基因型鉴定,1,、提取,DNA:,北京,QIAGEN,公司血液基因组提取试剂盒,提取所收集血样,DNA,北京六一仪器厂,DYY-II2,型电泳仪和电泳槽,DNA,样品电泳检测,紫外灯下判读结果，照相存档,2,、聚合酶链反应,-,限制性片段长度多态性（,PCR-RFLP,）,2.1 PCR,反应,德国,Eppendof,公司,PCR,扩增仪,设计并合成,CYP2C19,引物：,CYP2C19*2:,前引物,F,5,-AGCAGGTATAAGTCTAGGAAA-3,后引物,R,5,-ACAAATACGCAAGCAGTC-3,CYP2C19*3:,前引物,F,5,-ACTTTCATCCTGGGCTGTGC-3,后引物,R,5,ACTTCAGGGCTTGGTCAATA-3,三、基因型鉴定,建立反应体系：,蒸馏水,9,l,前引物,0.5,l,，,后引物,0.5,l,HotStar Taq Master Mix,12.5,l,（包含,4,种,dNTP,，,Mg2+,，,Taq DNA,聚合酶，以及,Tris,Cl-KCl,缓冲液）,DNA,模板,2.5,l,PCR,反应条件：,CYP2C19*2,：,94,预变性,15min,94,变性,40s,51,退火,30s,72,延伸,30s,循环,35,次，最后,72,延伸,10min,。产物长度,458bp,CYP2C19*3,：,94,预变性,15min,94,变性,30s,56,退火,30s,72,延伸,30s,循环,35,次，最后,72,延伸,10min,。产物长度,233bp,。,PCR,产物电泳检测,紫外灯下判读结果，,目的条带清晰且无非特异扩增者,进行下一步实验,照相存档,建立反应体系：,2.2,限制性长度多态性（,RFLP,）,美国,New England Biolabs,公司内切酶,SmaI,、,BamHI,酶切反应：,CYP2C19*2,：用限制型内切酶,SmaI30,消化,3h,。,SmaI,酶切条件：,PCR,反应产物,10ul,；水,16ul,；,10Buffer 2ul,；,SmaI 2ul,。,CYP2C19*3,：用限制型内切酶,BamHI37,消化,3h,。,BamHI,酶切条件：,PCR,反应产物,10ul,；水,18ul,；,10Buffer BamHI 2ul,；,BamHI 1ul,。,酶切产物电泳检测,紫外灯下判读结果，通过,条带数目及位置,，判断基因型,照相存档,3,、基因测序,取前引物,6l,，与,PCR,产物同时送于测序公司分析基因序列,四、数据分析,Spss 12.0 standard version(Spss Inc.),用双侧,t,检验和,2,检验。,P0.05,为差异有统计学意义,2.2 限制性长度多态性（RFLP）,第三部分 实验结果,一、病人一般情况和治疗情况,男,20,例，女,10,例，男女比例,2:1,平均年龄,33.624.60,岁，平均体重,56.1518.50kg,丙戊酸钠体重剂量范围,2.3-27.7mg/kg,d,平均值为,11.74mg6.10/kg,d,血药浓度范围,7.97-89.96,g/ml,平均值为,44.5927.60g/ml,二、血药浓度监测情况,测定血药浓度样品,150,例次,血药浓度有效范围：,40-100,g/ml,低于有效浓度低限共,65,例次,超过有效浓度高限共,2,例次,第三部分 实验结果一、病人一般情况和治疗情况,三、全血基因组,DNA,提取与,PCR,扩增产物,1,、琼脂糖凝胶电泳显示，提取的基因组,DNA,条带结果,2000bp,目的条带,Marker,图,2.,琼脂糖凝胶电泳检测提取的基因组,DNA,Fig 2.Apparent DNA ladder shown by agarose gel electrophoresis,三、全血基因组DNA提取与PCR扩增产物2000bp目的条带,2,、,CYP2C19*2,、,CYP2C19*3 PCR,扩增结果,CYP2C19*2 PCR,产物长度,458bp,500bp,458bp,目的条带,Marker,图,3.,琼脂糖凝胶电泳检测,CYP2C19*2PCR,产物,Fig3.PCR amplification of CYP2C19*2 shown by agarose gel electrophoresis,2、CYP2C19*2、CYP2C19*3 PCR扩增结果5,CYP2C19*3 PCR,产物长度,233bp,250bp,233bp,Marker,目的条带,图,4.,琼脂糖凝胶电泳检测,CYP2C19*3PCR,产物,Fig4.PCR amplification of CYP2C19*3 shown by agarose gel electrophresis,目的条带清晰，无非特异性扩增条带，说明,PCR,扩增较为理想，符合研究要求。,CYP2C19*3 PCR产物长度233bp250bp,四、基因型判定,1,、限制性片段长度多态性法,CYP2C19*2,突变位点：,681GA,当等位基因为,681G,时，,SmaI,酶将片断切开成为,272bp,和,186bp,两条片断,当等位基因为,681A,时，酶切位点消失，片段不被切开,据此分析酶切结果，判断基因型，见图,5,：,GG,基因型，也称野生型,-,272,、,186bp,两条片断,GA,基因型，也称突变杂合子,-,458,、,272,、,186bp,三条片断,AA,基因型，也称突变纯合子,-,458bp,一条片断,四、基因型判定,500bp,AA,型,AG,型,GG,型,458bp,272bp,186bp,Marker,图,5.CYP2C19*2,分型,Fig5.Genotype of CYP2C19*2,（,AA,为突变纯合型，,GG,为野生型，,AG,为突变杂合型）,(AA homozygous type,GG wild type,AG heterozygous type),500bpAA型AG型GG型458bp 272bp18,CYP2C19*3,突变位点：,636GA,当等位基因为,636G,时，,BamHI,酶将片断切开成为,137bp,和,96bp,两条片断,当等位基因为,636A,时，酶切位点消失，片段不被切开,据此分析酶切结果，判断基因型，见图,6,：,GG,基因型，也称野生型,-,137,、,96bp,两条片断,GA,基因型，也称突变杂合子,-,233,、,137,、,96bp,三条片断,AA,基因型，也称突变纯合子,-,233bp,一条片断,CYP2C19*3突变位点：636GA,250bp,233bp,137bp,96bp,GG,AG,Marker,图,6.CYP2C19*3,分型,Fig6.Genotype of CYP2C19*3,（,GG,为野生型，,AG,为突变杂合型）,(GG wild type,AG heterozygous type),250bp233bp137bp96bpGG AGMarker,2,、基因测序法,图,7.,基因测序图谱,从测序图谱分析：,在突变位点只有,G,峰的，为,GG,型,在突变位点只有,A,峰的，为,AA,型,在突变位点有,G,和,A,双峰的，为,AG,型,限制性片段长度多态性分析结果与基因测序结果一致,两种,DNA,鉴定方法相互验证，证明所建立的限制性片段长度多态性法准确、可靠,2、基因测序法图7.基因测序图谱从测序图谱分析：限制性片段长,五、等位基因和基因型分布,1,、基因频率与基因型,CYP2C19*2,的基因频率与基因型统计结果见下表,表,1.CYP2C19*2,基因频率与基因型分布,Tab.1 Frequency distribution of gene and genotype for CYP2C19*2,基因型,基因型频率,基因频率,GG,型,50.00%,基因,G 0.7333,GA,型,46.67%,基因,A 0.2667,AA,型,3.33%,五、等位基因和基因型分布表1.CYP2C19*2基因频率与基,CYP2C19*3,的基因频率与基因型统计结果见下表,表,2.CYP2C19*3,基因型及基因频率分布,Tab.2 Frequency distribution of gene and genotype for CYP2C19*3,基因型,基因型频率,基因频率,GG,型,88.89%,基因,G 0.9444,GA,型,11.11%,基因,A 0.0556,AA,型,0.00%,表2.CYP2C19*3基因型及基因频率分布Tab.,2,、双位点基因型,理论